关键词：
工程菌
酯酶B1
纯化
固定化
农药
摘要：
将抗性库蚊的解毒酶基因即酯酶B1 与含有强启动子PpsbA 的质粒pRL439 体外连接后,转化大肠杆菌DH5α,得到工程菌,该工程菌的表达产物酯酶B1 能高效降解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、菊酯等四大类农药。本研究将重组质粒pRL-B1 转入大肠杆菌DH5α,以5%的接种量转接到LB 液体培养基(含100μg/mL 氨苄青霉素)中,37℃,180rpm 震荡培养13h。5000rpm 离心收集菌体,超声波破碎工程菌,工程菌酯酶B1 降解酶经40%～80%的硫酸铵粗提,DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换层析、Sephadex G-150 凝胶过滤,得到了分离纯化,SDS-PAGE 鉴定为单一组分。凝胶过滤法测得分子量为56KD,提纯倍数为33.3,收率为17.9%,比活力为74.7U/mg。该酶的最佳作用条件是37℃,pH=7.0,该酶作用于α-乙酸萘酯的Km 为1.35×10 mmol/L,Vmax 为2.7×104 U /mL。酶在pH6 范围内较稳定,金属Mg对该酶具有明显的促进作用,而SDS 对酶具有抑制作用,对有机磷农药对硫磷(1605)的降解率在90min 内达91.5%。 采用海藻酸钙将工程菌酯酶B1降解酶经40%～80%的硫酸铵沉淀后的粗提液进行固定化,并测定了固定化酶对其特异性底物α-乙酸萘酯的降解特性。酶的最佳固定化浓度为0.15g/L,最佳固定化时间为12h,固定化酶最佳反应pH 为7.0.5,最适温度为40℃, 固定化酶显示出很高的热稳定性和重复使用稳定性,在常温下其半衰期为12d,利用双倒数法确定固定化酶的Km 为1.8×10 mmol/L, Vmax 为1.45×10 U/g,固定化酶的Km 比液态酶(1.35×10 mmol/L)的大1.33 倍,Vmax 只有液态酶(2.7×10U/mL)的近一半。利用气相色谱测得其对对硫磷(1605)的降解率在30min 内达53.8%。
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