关键词:
HaSNPV几丁质酶
分离纯化
毒理
大田试验
摘要:
棉铃虫单核多角体病毒(HaSNPV)能够分泌胞外几丁质酶,特异性水解昆虫和真菌细胞壁中的几丁质,抑制昆虫与真菌的生长和繁殖,严重时可引起害虫及病原菌死亡。本实验室将HaSNPV几丁质酶基因构建到真核表达载体pPIC9K中,并转化至毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115,得到基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA 4.0;通过对该菌筛选、诱导表达及优化,发酵获得可溶性的HaSNPV几丁质酶。在前期研究的基础上,本文开展了HaSNPV几丁质酶提取工艺、杀虫抑菌机制及大田防效的研究。
HaSNPV几丁质酶发酵上清液,经60-75%饱和度(NH4)2SO4盐析,收集沉淀,透析除盐获粗酶液;利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析,平衡缓冲液pH为8.0,上样量4.0 ml,洗脱液中NaCl的浓度为0.4 mol/L,洗脱液流速0.5 ml/min,浓缩收集液;再经Sephadex G-100凝胶过滤柱层析,经SDS-PAGE电泳检测,HaSNPV几丁质酶达到电泳纯,其含量为438.44 U/ml,纯化35.29倍,回收率为19.65%。
HaSNPV几丁质酶浓度为1.5 mg/ml,叶片浸渍饲喂小菜蛾幼虫72 h,胃毒作用校正死亡率达到75%;同样条件下,小菜蛾幼虫直接浸渍,触杀作用的校正死亡率为40.74%。上述实验表明,HaSNPV几丁质酶对小菜蛾幼虫具有触杀和胃毒双重作用,相同条件下胃毒大于触杀作用;小菜蛾幼虫对该酶无拒食作用。
HaSNPV几丁质酶对六种常见农业病原真菌具不同程度的拮抗作用,其中小麦根腐病菌的相对抑制率高达86.05%。
大田药效防治试验表明,目前常用的化学杀虫剂对小菜蛾防治有较高的速效性,但长期使用将使害虫产生抗药性,污染环境。HaSNPV几丁质酶对小菜蛾无拒食性,防治持效期长,施药9天后,小菜蛾幼虫的防治效果达93%。
通过对处理幼虫细胞结构研究,HaSNPV几丁质酶可分解小菜蛾幼虫表皮、中肠及围食膜胞壁几丁质,破坏细胞结构,导致虫体死亡。