关键词:
猪肺炎支原体
分离鉴定
生物学特性
诊断
动物模型
免疫原性
沙门氏菌
重组疫苗
胸膜肺炎放线杆菌
毒力试验
摘要:
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, MHP)可引起猪地方性流行性肺炎(Enzootic Pneumonia, EP),也是猪呼吸道疾病综合症的重要原发性病原之一。更重要的是,MHP的感染易造成多种其它病原微生物的继发感染,增加猪呼吸道疾病的发病率和死亡率,给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究开展MHP的病原分离鉴定、病原检测方法、重组沙门氏菌基因工程疫苗和重组猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因工程疫苗进行研究,为我国MHP的诊断、预防和控制提供新的方法,为MHP致病机制的研究提供基础。主要研究内容如下:
***的分离鉴定及基因序列分析
从我国送检的临床病例中有典型或凝似MHP症状的猪肺组织中分离出了1株MHP菌株,命名为HNYY。通过菌落形态观察、电镜观察、基因序列分析,分离鉴定的MHP菌株可以在MHP固体培养基中形成典型的“煎蛋样”菌落,菌落中心隆起,呈致密的小颗粒,中央颗粒较粗。通过电镜负染观察其形态,大多数为圆形。通过对MHP特异性的P36、P46以及16sRNA基因片段进行扩增测序分析,分离株的P36、P46和16sRNA序列与NCBI上报道的MHP序列进行比对,发现其同源性分别为100%、93%和96%。用MAGE4.0软件对这些基因进行进化分析,发现该分离株与国际232菌株的进化关系最近。
***分离株的致病性研究
筛选12头MHP和PRRSV血清抗体阴性的21日龄仔猪,分成两组。用分离的MHP菌株进行连续2次气管注射107个CCU的菌液,连续观察28天。分别对感染MHP后仔猪的体温、生长指标、精神状况、临床表现进行监测,对血清抗体和剖解后的组织病理切片和免疫组化进行分析。结果表明感染后仔猪的体温并没有升高,食欲和精神状况变化也不大,也并没有显示很明显的MHP临床症状。直到感染26天左右,体温才开始升高,部分猪也表现出咳嗽。但剖解后肉眼并没有观察到肺组织典型的MHP实质性的肉变或虾样肉变。通过测定平均日增重结果显示感染组的平均日增重比空白对照组低。血清抗体检测结果显示感染组并没有完全发生阳转。通过病理切片分析发现所有的肺组织均表现有不同程度的间质性肺炎和支气管纤毛上皮细胞脱落,而对照组均正常。用黏附素蛋白制备的多抗进行免疫组化分析结果显示感染组中所有的肺组织均为MHP阳性,说明分离的MHP菌株可感染仔猪,但并未造成严重的发病,初步鉴定为弱毒株。
3. Real-time PCR检测方法的建立
针对MHP保守的特异性基因——P36制备TaqMAN探针,建立用于检测MHP的FQ-PCR方法。该方法敏感度可达1×100拷贝/μ1,对批内起始浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106拷贝/μ1的pMD18-P36标准品的Ct值得变异系数(CV)分别为:0.6、0.5、0.5。批间起始浓度为1.0×108、1.0×107、1.0×106拷贝/μ1的pMD18-P36标准品的试验的Ct值变异系数(CV)分别为:7.6、7.9、3.4。检测的灵敏度比普通PCR高100倍。说明该方法具有良好的特异性、稳定性和重复性。
4.在大肠杆菌中的表达及反应原性分析
根据MHP免疫原性基因相关的研究报道,我们选取主要的免疫原性基因P46、P65、P97R1和NrdF进行分析,结果显示P46基因序列中含有3个TGA密码子,分别位于碱基序列的208、301和760位;P65基因序列中含有1个TGA密码子,位于碱基序列的631位;而P97R1序列是黏附素基因中起主要黏附作用的位点,位于黏附素基因P97序列中的2560-2889,序列中无TGA密码子;NreF基因序列编码一个11 Kda蛋白,无TGA密码子。分别将P46、P65、P97R1NrdF构建在原核表达质粒pGEX-KG于宿主菌JM105中进行表达并纯化蛋白,其大小分别为72 KDa,91 KDa,62 KDa和50 KDa。
5.表达MHP保护性抗原的重组沙门氏菌株的构建
分别将P46、P65、P36、P97R1NrdF基因片段与沙门氏菌asd平衡表达质粒pYA3493进行连接,制备重组平衡表达质粒pYAP46、pYAP65、pYAP36和pYAP97R1N。将这些质粒分别电转化猪霍乱沙门氏弱毒株C501中,制备重组菌株C501(pYAP46)、C501(pYAP65)、C501(pYAP36)、C501(pYAP97R1NrdF)均保留了亲本株C501的生化特性和抗原表型,能稳定遗传并高效表达MHP的P36、P46、P65和P97R1NrdF抗原。
***重组沙门氏菌基因工程疫苗对小鼠免疫效果的观察
利用表达MHP免疫原形基因P46、P65、P36、P97R1NrdF片段