关键词:
基因工程黑暗链霉菌
妥布霉素
分离纯化
HPLC-ELSD
摘要:
目前国内生产妥布霉素大多是采用产生氨甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵来获得含氨甲酰妥布霉素的发酵液,然后在提取过程中水解氨甲酰妥布霉素的氨甲酰基团来生产妥布霉素。这种工艺存在着提取困难、生产周期长、收率偏低等一系列缺陷。针对这些问题,本研究依托本实验室的基因工程黑暗链霉菌,对妥布霉素的分离提取进行了研究,以期建立一条适用于此基因工程菌发酵产物的技术路线。 为评估纯化中间体的分离效果,本研究建立了针对中间体的HPLC-ELSD法并对流动相及操作参数进行了优化。确定采用0.1 mol·L-1三氟乙酸溶液作为流动相,雾化管温度40℃,漂移管温度80℃,载气压力0.35 Mpa。使用离子交换法对基因工程黑暗链霉菌的发酵产物进行了提取,通过薄层色谱(TLC)、高效液相(HPLC-ELSD)及质谱(MS)确定其主要组分为妥布霉素和卡那霉素B。为代替经典提取工艺中使用的732强酸性阳离子树脂,以发酵液为原料筛选了六种不同类型阳离子交换树脂。发现大孔弱酸性树脂HD-2具有吸附总量高、易于洗脱的特点。 运用比较实验确定操作参数为吸附pH值6.8、解吸剂为0.1 mol·L-1氨水溶液,流速1.0ml·min-1。采用阴离子交换树脂H401进行柱层析分离,确定层析分离操作条件:上样量为5ml,洗脱剂为0.6%(V/V)氨水溶液,流速0.5 ml·min-1,层析后妥布霉素纯度达到89.70%。妥布霉素成品纯度可达到93.21%,总收率41.49%。