关键词：
红花钓钟柳
狭叶松果菊
松果菊苷
高速逆流色谱
次生代谢
基因克隆
摘要：
松果菊苷既是一种咖啡酸类衍生物,也是一种苯乙醇苷类化合物,具有多种药理学活性,如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、神经保护作用、保肝作用以及对免疫系统产生刺激作用。松果菊苷最早发现于狭叶松果菊,其含量约为0.2%,后亦在克氏钓钟柳中发现,含量约为0.09%。目前,松果菊苷主要从一种寄生于梭梭的管花肉苁蓉中提取。在2005版中华人民共和国药典中,管花肉苁蓉的唯一质量控制标准是,松果菊苷的含量不低于1.0%。管花肉苁蓉只分布于沙漠和戈壁一带,生长缓慢,且难于栽种。然而,近年来随着松果菊苷商业价值的不断提高,管花肉苁蓉的市场需求也在不断增长,管花肉苁蓉被过度开发,已经成为濒危植物。因此,寻找管花肉苁蓉的替代资源显得尤为紧迫。 本研究通过高效液相色谱筛选到富含松果菊苷的药源植物红花钓钟柳(Penstemon barbatus (Can.) Roth),利用高速逆流色谱快速分离制备松果菊苷纯品用于波谱学鉴定。为了提高次生代谢产物松果菊苷的含量,利用分子生物学方法,在其生物合成的基因工程领域开展了探索性研究。获得的主要结果如下： 1.首次发现红花钓钟柳中含有松果菊苷,并测定了根和叶中含量的年变化。 通过筛选首次发现红花钓钟柳含有松果菊苷,其根和叶中松果菊苷的含量随季节变化,在一年中,最高含量分别在十一月和五月达到7.25±0.36 mg/g和9.09±0.32 mg/g。结果表明,红花钓钟柳中松果菊苷的含量十分接近管花肉苁蓉中松果菊苷的含量水平,其有可能替代管花肉苁蓉,而用于规模化生产松果菊苷。 2.利用循环高速逆流色谱等技术从红花钓钟柳根中得到含量为96.3%的松果菊苷纯品42.0 mg,并确定其结构。 从红花钓钟柳中分离得到松果菊苷纯品。利用50%甲醇超声提取20 g红花钓钟柳根的粉末,所得到的甲醇提取物经AB-8树脂预纯化后,以正丁醇：甲醇(1：1,v/v)为溶剂系统,通过经典高速逆流色谱和循环高速逆流色谱纯化。最终获得了纯度为96.3%的松果菊苷42.0mg。循环HSCCC的回收率为91.0%。获得的松果菊苷纯品由IR,H NMR and CNMR进行了结构确认。 3.完成了狭叶松果菊中3-脱氢奎尼酸合成酶基因aroB的克隆及其组织表达特征研究。 以狭叶松果菊(*** DC)组培苗为材料,用Trizol法提取总RNA,根据已有的3-脱氢奎尼酸合成酶基因aroB保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条289bp的aroB基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)及序列拼接,最终得到该基因cDNA序列,命名为EanaroB, Genbank登录号为EU293857。分析结果表明,EanaroB cDNA长1424bp,包含一个1326bp的开放读码框,氨基酸序列同源分析结果发现,EanaroB编码的氨基酸序列与番茄、葡萄、拟南芥、山毛榉的aroB同源性都在80%左右,表明aroB氨基酸序列具有较强的保守性。半定量RT-PCR结果表明,狭叶松果菊EanaroB基因在狭叶松果菊的根、茎、叶、花中均有表达,但花和叶中的表达量较高,在根和茎中较少。 4.构建了pCAMBIA2301G-EaC4H1高效植物表达载体并获得基因工程农杆菌 对含有源于狭叶松果菊的EaC4H1 (Genbank登录号为EU676019)的pMD18-T和中间表达载体pCAMBIA2301G分别进行SacⅠ和XbaⅠ双酶切。由于EaC4Hl基因内含有SacⅠ酶切位点,经不完全酶切产生4条电泳条带,回收1602bp的目的基因条带和约12kb的pCAMBIA2301G载体骨架条带。将回收的pCAMBIA2301G载体骨架与酶切后产生的EaC4H1目的基因片段连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α。抽提质粒后转化农杆菌。经PCR验证,获得与目的基因大小一致的条带。结果表明工程农杆菌LBA4404-pCAMBIA2301G-EaC4H1已构建成功。上述工程菌可用于遗传转化狭叶松果菊或红花钓钟柳,对在分子遗传学水平上探讨C4H在咖啡酸衍生物生物合成中的作用机理,并为进一步获得富含松果菊苷的转基因狭叶松果菊和红花钓钟柳奠定了基础。
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