关键词:
成体干细胞
小涎腺间充干细胞
小涎腺上皮干/祖细胞
生物工程化唾液腺类器官
再生医学
摘要:
研究背景及意义再生医学的理念为口干症的治疗提供了新的思路,其中种子细胞的获得和唾液腺功能重塑是关键环节。小涎腺具有与大涎腺相似的结构与功能,同时具有来源广泛,取材方便与供区损伤小的优点,是理想的成体干细胞来源。目前对于人小涎腺组织中的成体干细胞的研究很少,无详细的报道。上皮-间质共培养是经典的体外组织构建模式,可用于器官再生和发育研究。由人小涎腺来源种子细胞构建生物工程化唾液腺类器官,将为疾病临床治疗和器官发育研究提供理论基础和技术支持。研究目的1.由人小涎腺组织分离鉴定具有自我更新能力的成体干细胞,为构建生物工程化唾液腺寻找种子细胞。2.体外构建具有功能的生物工程化唾液腺类器官,并探究其临床应用的可能性。研究内容1.人小涎腺间充质干细胞的分离与鉴定方法 用组织块培养法对人小涎腺组织进行原代培养,用克隆环方法分离获得纺锤样间充质干细胞,在体外扩增培养,获得人小涎腺间充质干细胞(hMSGMSCs).MTT法检测细胞生长曲线,以及克隆形成实验鉴定hMSGMSCs的自我更新能力。流式细胞术和细胞免疫荧光的方法鉴定hMSGMSCs的细胞表面标志物和特异蛋白的表达。对分离培养获得的hMSGMSCs进行中胚层、内胚层及外胚层方向的诱导分化,并将体外诱导获得的骨、软骨组织植入体内观察转归。构建小鼠急性肝损伤模型,观察hMSGMSCs作为种子细胞进行细胞治疗的可能性。结果 用组织块原代培养方法可获得纺锤样间充质干细胞hMSGMSCs,体外稳定传代至P20代,MTT法测定细胞群体倍增时间为66小时,克隆形成率为41.00±8.83%。流式细胞检测得细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,以及其它成体干细胞标志物***-1和Nestin.体外诱导后,hMSGMSCs可向中胚层骨、软骨和脂肪细胞分化,相关基因RUNX2、P7、GLAP、 SPP1;SOX9、ACAN、COL2A1;PPARG与CEBPA表达升高,并有特殊染色鉴定细胞分化成熟,进一步体内实验证实诱导后hMSGMSCs在体内有异位成骨、成软骨的能力。对hMSGMSCs进行神经细胞诱导后,可观察到细胞出现神经细胞形态,与NES,GFAP和TUBB3的基因相对表达水平显著升高。对hMSGMSCs进行成肝细胞诱导,可观察到细胞形态向卵圆形转变,诱导过程中观察到内胚层前体细胞标志物FOXA2、Sox17和CXCR4先升高后降低,肝细胞标志物AFP、ALB和KRT18持续升高,诱导后细胞免疫荧光检测验证蛋白阳性表达。对肝损伤动物模型进行尾静脉hMSGMSCs细胞移植,2周后取材可见肝内存在标记细胞的阳性信号,免疫荧光共染可见阳性共表达新生肝细胞标记物AFP等。结论由人小涎腺组织块原代培养法可获得具有自我更新和多向分化能力的间充质干细胞hMSGMSCs。该细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物和一些成体干细胞标志物。以其作为种子细胞可在体内异位成骨、成软骨,移植入急性肝损伤小鼠体内后可以观察到细胞定植和分化,提示其应用于临床细胞治疗的可能性。2.基因表达谱比较分析人小涎腺间充质干细胞与其他组织来源MSC方法原代培养人骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞至P3代,与上文研究中获得的P3代hMSGMSCs进行比较,收集细胞RNA,进行全基因组表达谱芯片检测。对芯片结果进行比较,获得差异表达基因,进行聚类分析和GO、KEGG信号通路比对综合分析差异基因的作用。结果 统计分析芯片数据结果后发现hASCs与hMSGMSCs相比,387基因上调,533基因下调;hBMSCs与hMSGMSCs相比,234基因上调,192基因下调。对其中差异值较大的257个基因进行分层聚类发现hMSGMSCs与hASCs更易聚类。GO基因功能注释和KEGG Pathways在线数据库对这些hMSGMSCs特异性上调或下调的基因进行综合分析,可以发现这些基因主要与免疫反应、受体结合和胞外区功能相关,而富集的信号通路包括细胞因子受体相互作用、化学因子信号通路和NOD样受体信号通路。小结 三种间充质干细胞全基因组表达谱分析结果显示hMSGMSCs与hASCs更易聚类,差异基因聚类于免疫反应、受体结合和胞外区功能,富集的信号通路包括细胞因子受体相互作用、化学因子信号通路和NOD样受体信号通路。3.人小涎腺上皮来源干/祖细胞分离与立体培养研究方法组织块培养法原代培养人小涎腺上皮来源干/祖细胞(hMSGSCs), MTT法检测细胞生长曲线,以及克隆形成实验鉴定hMSGSCs的自我更新能力。流式细胞术和细胞免疫荧光的方法鉴定hMSGSCs的细胞表面标志物和特异蛋白的表达。在Matrigel中对hMSGSCs进行立体培养、观察激活不同信号通路对hMSGSCs的影响。结果用组织块培养