关键词：
哮喘
荧光共振能量转移技术
天然先导化合物
体外筛选模型
信号转导通路
黄酮苷母环
摘要：
研究背景和目的: 近年来研究表明:ERK1/2信号通路的异常激活在哮喘发病及气道重构的病理生理过程中拥有重要地位。研究提示：针对ERK1/2信号通路的调控治疗可能为哮喘气道重构防治提供一个新的策略。我们先前发现：中药验方存在对ERK信号通路具有调节作用的天然化合物分子,可能是其治疗哮喘的重要分子药理机制之一。基于此,本研究利用近年来发展的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术原理,构建以CFP-ELK-YFP荧光融合蛋白为FRET探针的,能够实时对ERK激酶的活性进行动态观察,并能筛选具有调节信号通路作用的中药单体的体外模型。应用该模型进行初步筛选的结果表明：带有黄酮苷母环的单体,具有类似PD98059的ERK1/2信号转导通路的特异性抑制效应。该模型的建立为进一步的天然先导化合物的筛选奠定了基础。 研究内容与方法: 第一部分 CFP-YFP FRET阳性对照荧光蛋白的原核表达纯化与荧光特性研究构建原核表达载体pGEX-4T-1/CFP、pGEX-4T-1/YFP、pGEX-4T-1/CFP-YFP,诱导表达,纯化目的荧光融合蛋白。用多功能酶标仪测定荧光蛋白CFP、YFP的特性和CFP-YFP的FRET现象。 第二部分 应用荧光共振能量传递(FRET)技术原理构建靶向ERK1/2信号通路天然化合物的体外筛选模型构建原核表达载体pGEX-4T-1/CFP-ELK、pGEX-4T-1/ELK-YFP、pGEX-4T-1/CFP-ELK-YFP,诱导表达,纯化目的荧光融合蛋白。用多功能酶标仪测定CFP-ELK-YFP的FRET现象,观察和比较加入ERK1/2激酶、以及加入激酶抑制剂PD98059前后FRET-YFP/CFP荧光峰值的比值变化,在达到预期目标的基础上,以此模型筛选具有相同抑制作用的中药单体。 结果： 第一部分 CFP-YFP FRET阳性对照荧光蛋白的原核表达与荧光特性研究纯化后的GST-CFP,GST-YFP,GST-CFP-YFP,分子量大约为52.5kDa,52.6kDa,7902kDa,与预期值相符。荧光分析表明,GST-CFP、GST--YFP与无标签蛋白GST的CFP、YFP的荧光激发及发射波长基本相同,荧光性质稳定。当GST-CFP-YFP用CFP的激发波长激发,YFP的滤光片检测,CFP的能量共振转移到YFP上,存在明显的FRET现象。 第二部分应用荧光共振能量传递(FRET)技术原理构建靶向ERK1/2信号通路天然化合物的体外筛选模型纯化后的CFP-ELK-YFP荧光融合蛋白在加入ERK2激酶,ATP前,与对照同样,存在明显的FRET现象。加入ERK2激酶,ATP后,FRET-YFP/CFP荧光峰值的比值减弱,加入ERK2激酶,ATP前0.5399±0.0946,加入ERK2激酶,ATP后0.3999±0.0727,P值=0.000。加入PD98059后,FRET-YFP/CFP比值较前增强,加入PD98059前0.3999±0.0727,加入PD98059后0.6020±0.1253,P值=0.000。与PD98059性能相同,大豆苷元,野黄芩苷,2”-0-没食子酰基金丝桃苷均能对抗ERK1/2激酶介导的FRET-YFP/CFP荧光峰值的比值下降,大豆苷元P值=0.000,野黄芩苷P值=0.000,2”-0-没食子酰基金丝桃苷P值=0.000。 结论: 1、原核表达的GST-CFP-YFP融合蛋白其CFP、YFP荧光性质稳定,存在明显的FRET现象,与文献报道一致。 2、构建的CFP-ELK-YFP/ERK2激酶一体外FRET筛选模型经加入ERK2激酶及追加特异性抑制剂PD98059后FRET效应的变化均具有统计学意义,表明成功建立基于FRET原理的ERK1/2信号转导通路抑制剂体外筛选模型。 3、应用该模型对中药单体初步筛选的结果表明：与PD98059化学结构类似,含黄酮苷母环的中药单体具有ERK1/2激酶特异性抑制效应。提示该模型可以用于筛选具有ERK1/2激酶特异性抑制效应的天然先导化合物。
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