关键词:
黄曲霉毒素B1
呕吐毒素
玉米赤霉烯酮
表面等离子谐振
玉米
摘要:
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮毒素(Zearalenone,ZEN)是饲料中对畜禽危害较大的三种真菌毒素;通过污染植物性原料感染饲料,是继细菌和病毒以外的第三大致病因素,可引起畜禽真菌毒素中毒症。因此,对真菌毒素的检测和监控就变得很有必要。目前,真菌毒素检测方法很多,但这些方法都不同程度地存在样品前处理复杂、操作时间长等缺点,探索快速准确的真菌毒素检测方法是当前热点研究领域。表面等离子谐振(Surfaceplasmon resonance,SPR)技术操作简单、灵敏度高、检测时间短、耗样量少、无需标记,能实时监测反应动态过程、无需纯化各种生物组份、只需对样品进行简单处理等优点,已广泛用于化学性危害物的检测领域。目前在检测玉米和饲料真菌毒素方面,还极少有SPR高通量检测方法的报道。本研究制备了 AFB1、DON、ZEN的人工完全抗原。采用化学偶联法,以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)为载体蛋白分别制备了免疫抗原(AFB1-BSA,DON-BSA,ZEN-BSA)和包被抗原(AFB1-OVA,DON-OVA,ZEN-OVA)。使用上述免疫抗原对Balb/c小鼠进行免疫,并采用杂交瘤细胞技术将小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合,经筛选后成功制备出AFB1、DON、ZEN单克隆抗体。使用包被抗原对抗体进行鉴定,三种毒素抗体与其它真菌毒素无交叉反应,具有良好的特异性,抗体的亲和力分别是5.4× 107mol/L、7.5×106mol/L、3.1×107mol/L,能够达到检测要求。本研究分别建立了玉米中AFB1、DON、ZEN的SPR检测方法。将AFB1-OVA结合到羧基修饰的SPR芯片上,根据抗原包被的结合区间优化和检测AFB1芯片条件,结果表明使用乙酸盐缓冲条件下偶联比例最高,根据流速结合曲线确定AFB1-OVA最适包被浓度为0.02 mg/mL、最适AFB1单抗稀释度为1:10000。建立的检测玉米中AFB1直接竞争SPR检测方法,检测限为2.94 μg/kg。同样,优化了 DON和ZEN SPR检测方法的最适条件,玉米中DON和ZEN SPR检测方法的检测限分别为96.22 μg/kg和9.32 μg/kg。经实际样本测试,SPR检测方法与HPLC方法的相关性良好,R2均大于0.95。最后,本研究建立了同时检测玉米中AFB1、DON和ZEN的SPR检测方法,检测限分别为3.77μg/kg,109.08 μg/kg和11.11μg/kg。50份实际样本检测结果显示,SPR检测方法与HPLC方法的相关性良好,R2均大于0.94,表明本研究所建立的检测方法能够满足实际样本的检测需求。