关键词:
电化学
核酸检测
比率型检测
生物传感器
电沉积
摘要:
众所周知,核酸是物种保持进化和世代繁衍的物质基础。传统的核酸检测技术需使用酶和精密的控温仪器等,增加了检测成本。DNA电化学生物传感器因其具有无需靶标扩增过程、特异性强,且微型化应用的特点,已被认为是最有前途的生物标志物快速检测方法,并引起了广泛的关注和研究兴趣。本论文基于电化学生物传感器核酸检测技术开展了如下研究。比率型检测因其具有良好的稳定性和抗干扰能力,在电化学生物传感器的构建中得到了广泛应用。然而,如何通过比率型检测来构建高灵敏度的电化学生物传感器仍然是一个挑战。在本研究中,借助于临近界面杂交和发卡型捕获探针结构的高度特异性且能够进一步降低检测背景的特点,并结合比率型检测的优势,构建一种新型比率型电化学生物传感器核酸检测技术。发夹型捕获探针结构的设计能够减少在没有靶标的情况下与检测探针杂交的可能性,进一步提高检测的特异性。且比率型检测能够消除由实验条件引起的信号波动误差,提高检测的稳定性。此生物传感器在靶标DNA浓度范围1.0×10-12M到1.0×10-16M间具有良好的线性关系,且灵敏度较高,检测限能够达到6.4×10-17M。此外,该生物传感器具有良好的生物选择性,能够识别单碱基错配的靶标。因此,该比率型电化学生物传感器在食品分析和医学诊断等方面具有广泛的应用前景。在传统的电化学生物传感器制备过程中,捕获探针的固定耗时较久,一般需过夜修饰12 h。所以可通过减少探针修饰时间来提高电化学生物传感器靶标检测效率。靶标DNA链的5'端修饰有二茂铁基团,因此本研究可通过检测二茂铁电化学信号来表征靶标杂交结果。首先,通过吡咯电聚合化学包埋法修饰DNA探针,即把捕获探针通过外加电场包埋到聚吡咯的网状结构中。研究发现这种方法修饰的探针在电极表面是无规律排列的,所以对此进行了改进。在捕获探针的3'端修饰有吡咯单体,通过电聚合吡咯共价键合法进行探针的修饰。此种方式在金电极表面形成的探针比较规律。但是这两种方法在靶标杂交后都检测不到二茂铁信号。根据研究推测可能是在金电极表面形成的吡咯层太厚或捕获探针完全包埋到聚吡咯层中,阻碍了二茂铁在金电极表面的电子传递或无法进行后续靶标杂交过程。最终本研究通过电沉积方法将3'端修饰巯基的DNA捕获探针链固定到金电极表面,此过程只需要5min。这种修饰捕获探针的方法达到了本研究检测二茂铁电化学信号的要求,且极大缩短了电化学生物传感器检测靶标的时间。本研究采用的电沉积修饰捕获探针的方法为生物传感器的批量化生产、靶标的现场高效率检测提供了研究新思路。