关键词:
电化学传感器
病原微生物
即时检测
生物分子
细菌
病毒
摘要:
病原微生物的检测是一项关系人类健康的重要课题,在生物安全防护、食品安全、临床诊断、环境监测等领域具有重要意义。现场快速检测是病原微生物检测的重要目标,也是病原微生物检测的难点和挑战。因此,亟需开发用于现场的快速检测技术,以满足病原微生物即时检测操作简单、检测速度快、灵敏度高的要求。电化学传感器具有检测速度快、灵敏度高、抗干扰性强、操作简单、成本低等优点,有潜力实现病原微生物的现场快速检测。纸基电化学传感器因其成本低廉、制作简单有望实现现场快速检测,近年来成为研究热点,但在检测灵敏度、检测速度方面仍有提升空间。基于此,本文提出一种基于静电纺醋酸纤维素纳米纤维膜(CA NFM)纸基电化学传感器的检测技术,通过结合纳米材料与纸基电化学传感器实现生物分子、细菌和病毒的检测。利用纳米纤维膜比表面积大、生物相容性高、制备过程简单等优势,增强纸基电化学传感器的检测能力,为病原微生物即时检测技术研究提供一种新的选择。(1)CA NFM纸基电化学传感器的制备与表征。设计三电极芯片结构,选取碳作为工作电极与对电极材料,Ag/Ag Cl作为参比电极材料,通过丝网印刷技术制备纸基电化学传感器。结合静电纺丝技术在纸基电化学传感器电极表面覆盖醋酸纤维素纳米纤维膜,利用纳米纤维膜多孔隙、高生物相容性及亲水性好的优势,为生物识别分子提供更多的结合位点,并使样本溶液与传感器检测区域充分接触,以增强纸基电化学传感器的检测能力。通过优化静电纺丝电压与纺丝时间(分别为16 k V和10 min),得到直径分布均匀的醋酸纤维素纳米纤维膜,制备出CA NFM纸基电化学传感器。通过传感器的系列表征证明生物识别分子成功被固定在传感器的检测区域表面。(2)基于CA NFM纸基电化学传感器实现葡萄糖的检测。首先,在CA NFM纸基电化学传感器检测区域固定葡萄糖氧化酶,实现了对不同浓度葡萄糖溶液的检测,检测线性范围为1 nmol/m L-100μmol/m L,检测限为0.71 nmol/m L,检测时间约为5 min。然后,CA NFM纸基电化学传感器的稳定性研究结果表明,该传感器在室温环境下存放30 d,传感器的电化学响应可保持在98%以上。通过同批次的传感器在相同条件下的重复实验,证明CA NFM纸基电化学传感器具有较好的重现性,偏差小于8%。(3)基于CA NFM纸基电化学传感器实现蛋白大分子的检测。首先,以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B为目标蛋白,该传感器实现了100 fg/m L-10μg/m L浓度范围的检测,检测限可达89.1 fg/m L,检测时间为400 s。与其他电化学传感方法相比较,CA NFM纸基电化学传感器具有检测范围广,检测限低等特点,说明醋酸纤维素纳米纤维膜凭借自身的高孔隙率和亲水性等优势,增加了抗体在传感器检测区域的结合位点,增强了CA NFM纸基电化学传感器对蛋白大分子的检测能力。然后,修饰Ag85B抗体的CA NFM纸基电化学传感器对Ag85B的电流响应为其他蛋白的4~10倍,证明该传感器具有良好的选择性。最后,将CA NFM纸基电化学传感器与经典的酶联免疫吸附测定法(ELISA)小鼠免疫球蛋白G的结果对比,表明CA NFM纸基电化学传感器的检测范围更广,检测限更小,并且检测过程操作简单,检测速度快。(4)基于CA NFM纸基电化学传感器实现细菌及病毒的检测。以大肠杆菌O157:H7为检测对象,在CA NFM纸基电化学传感器的检测区域表面修饰大肠杆菌O157:H7单克隆抗体,与待测样本溶液中的大肠杆菌O157:H7进行特异性结合,实现了浓度范围为1.5×10-1.5×10CFU/m L的细菌检测,检测限可达30CFU/m L,检测时间400 s。且该传感器对不同浓度的菌悬液的电化学响应电流与对应浓度之间呈线性相关,相关系数R为0.97。该传感器分别对相同浓度的大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌ATCC8099和枯草芽孢杆菌ATCC9372溶液进行检测,大肠杆菌O157:H7信号强度是另外两个的2倍以上,证明该传感器具有良好的特异性。与研制的电阻抗流式传感器对细菌进行非标记检测相比,电阻抗流式检测难以实现对细菌种属的有效识别和区分,检测时间较长;而CA NFM纸基电化学传感器可实现细菌的特异性识别,且检测速度快。以肠道病毒71型为检测对象,CA NFM纸基电化学传感器实现了浓度为1 pg/m L-100 ng/m L的EV71的检测,检测限0.48 pg/m L,检测时间400 s,电化学响应电流与溶液浓度之间线性相关系数R为0.957。综上,本文提出的基于CA NFM纸基电化学传感器的病原微生物检测技术,可以实现病原微生物的蛋白标志物、细菌细胞及病毒颗粒的高灵敏度、快速检测,并具有良好的稳定性、重现性及特异性,有望应用于病原微生物的现场快速检测