关键词:
电磁场
骨髓间充质干细胞
成骨细胞
成骨分化
成软骨分化
摘要:
目的(1)体外条件下,分离及纯化培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,并对所得的细胞进行细胞表型鉴定及三系分化鉴定。(2)评估细胞增殖能力,并检测条件培养下极低频电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞成骨相关指标表达的影响。(3)研究共培养条件下极低频电磁场干预对大鼠成骨细胞及骨髓间充质干细胞成骨分化的影响,并探索体内环境下电磁场促进细胞增殖及诱导成骨分化的可能机制。(4)研究条件培养下极低频电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响,并探讨极低频电磁场在间充质干细胞相关软骨组织工程学中的应用价值。 方法采用梯度密度离心法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,并结合差速贴壁培养法,使细胞在体外扩增过程中得以纯化,提高骨髓间充质干细胞的纯度,并将形态及增值能力较好的第三代至第六代细胞用于后续试验。 (1)采用流式细胞技术及细胞免疫组织化学技术检测所培养细胞的表面标志物,并分别使用三系分化(成骨分化、成软骨分化、成脂分化)诱导培养基对所分离及培养的细胞进行诱导培养,通过鉴定细胞的多向分化潜能,确认所分离及培养的细胞为骨髓间充质干细胞。 (2)将体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞随机分为三组:空白组、暴磁组、成骨诱导复合暴磁组。①采用MTT比色法分别检测各组细胞的增殖活性,绘制细胞生长曲线;②三组细胞体外培养两周后,按随机数字表法随机选取各组细胞进行细胞总RNA的提取,逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞成骨相关指标的基因表达情况,这些指标包含:ALP、Col1α2、Runx2、Bglap。 (3)体外分离及培养大鼠成骨细胞,通过使用Transwell培养小室,将大鼠成骨细胞与骨髓间充质干细胞在体外建立共培养体系以模拟体内微环境,并将共培养体系随机分为共培养组和共培养暴磁组,另外将未进行共培养的成骨细胞和骨髓间充质干细胞纳入单细胞组,其中暴磁组每日给予50Hz,1mT正弦波电磁场刺激4h。实验进行两周后,随机提取各组细胞总RNA,逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞成骨相关指标的基因表达情况,检测指标包括:Runx2、Sp7、ALP、 Bmp2、Col1α2和Bglap;另随机选取各组细胞进行茜素红矿化结节染色,并使用专业分析软件对染色结果进行定量分析。结合基因检测结果及矿化结节染色结果,分析极低频电磁场对成骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养体系的影响,从而探讨论电磁场在体内微环境下促进骨髓间充质干细胞成骨分化的可能机制。 (4)大鼠骨髓间充质干细胞培养至第五代后,采用微团培养法培养,将细胞微团随机分为暴磁不加药组,非暴磁加药组和暴磁加药组,其中加药组培养基中含FGF-2和TGF-p3,暴磁组每日给予50Hz,1mT正弦波电磁场刺激4h。培养21天后,随机提取各组细胞总RNA,逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞成软骨相关指标的基因表达情况,检测指标包括:Aggrecan、Col2α1、Col10α1和Sox9;同时随机选取各组细胞微团进行糖胺多糖(GAG)/DNA含量测定,并使用阿利新蓝染色检测细胞微团中软骨基质分泌情况。结合成软骨指标的基因表达水平与GAG/DNA含量及阿利新蓝染色结果,从而探讨电磁场在生长因子(FGF-2, TGF-β3)存在情况下对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响,并探讨极低频电磁场在间充质干细胞相关软骨组织工程学中的应用价值。 结果(1)所分离培养的细胞在倒置显微镜下观察呈梭形或三角形,有较强的折光性;生长迅速,常呈鱼群样或漩涡样生长,9-12天可铺满培养瓶底。三系诱导分化结果:在成骨分化诱导培养21天后可形成大量钙结节;在成脂分化诱导培养14天后有大量脂滴形成;成软骨分化诱导培养21天后细胞软骨基质分泌,有典型软骨陷凹形成。细胞免疫组织化学染色结果示CD29、CD44、CD90阳性表达,CD34阴性表达。流式细胞技术鉴定结果显示,细胞表面分子CD29、CD44、CD90阳性表达率均大于95%,而CD34阳性表达率小于5%,这表明所分离培养的细胞中几乎无造血细胞系,细胞均一性良好,因此符合骨髓间充质干细胞表面标记物的特征。 (2)极低频电磁场干预可明显促进骨髓间充质干细胞的增殖,但在成骨分化诱导培养条件下,极低频电磁场促进细胞增殖的效应不明显。培养两周后,实时定量PCR结果显示,相对于空白组,成骨诱导复合暴磁组中BMSCs成骨相关基因Runx2、ALP、 Coll α1及Bglap的表达明显上升,而单纯暴磁组基因表达与空白组无明显差异(P>0.05)。提示在单纯电磁场干预不能促进骨髓间充质干细胞成骨分化。 (3)实时荧光定量PCR结果示单细胞培养组大鼠BMSCs及成骨细胞Runx2、Sp7、 ALP、Colla2、Bglap基因表达水平均相对较低,而共培养组大鼠BMSCs及成骨细