关键词:
电磁场
间充质干细胞
细胞迁移
细胞骨架
SOCE
Piezol
摘要:
目的:
细胞迁移是细胞主要功能之一,涉及细胞骨架的重组和调节分子的不对称分布。在创面愈合、毛囊再生等过程中,细胞迁移是复杂的,前期研究证实作为物理刺激因子之一的低频电磁场(Electromagnetic field,EMF)可以促进创面愈合、毛囊再生等,但EMF如何改变细胞骨架促进细胞迁移特别是方向性迁移值得深入研究;而Ca2+是一种多效性第二信使,可以受到环境、生化、物理等刺激影响细胞迁移,探讨EMF如何调控间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)胞内Ca2+可以帮助理解EMF对细胞迁移作用。
方法:
1.培养鼠来源的MSCs,经EMF(50Hz,5mT)干预3h后,用Transwell实验、划痕实验等检测细胞的迁移能力;免疫荧光技术观察在平面和创缘MSCs中β-COP、γ-tubulin的定位、观察Flutax1在MSCs中的分布。
2.分别使用 Taxol、Nocodaloze、Cytochalasin D 和 Phalloidin 等细胞骨架稳定或解聚剂处理MSCs并EMF干预后,免疫荧光方法检测α-Tubulin和F-actin,探讨EMF对微管-肌动蛋白相互作用的影响。
***干预后,RNA-seq获取差异性表达基因并KEGG分析信号富集情况,流式细胞术检测Ca2+浓度;然后,检测EMF干预后MSCs细胞储存操作Ca2+进入(Store-Operated Ca2+Entry,SOCE)激活情况,并分析 SOCE 介导 Ca2+内流在EMF对α-Tubulin乙酰化和F-actin影响中的作用;Western Blot检测GEFH1-ROCK信号轴中关键蛋白表达。
***1选择阻断Piezol通道并经EMF干预,检测SOCE激活情况,Western Blot和免疫荧光方法检测Piezol、SOCE关键组件Orai1和STIM1的表达和分布,Duolink?原位PLA技术检测F-actin和Orail的相互作用;分析Piezol通道在EMF增强SOCE过程中细胞骨架改变适应Ca2+内流产生促细胞迁移效应中的作用。
结果:
1.当EMF干预MSCs 3h后,细胞的迁移能力明显增强;在这过程中,EMF促进β-COP在胞内不对称分布,增强了 MSCs的极性,增强了创缘MSCs能动性和β-COP、γ-tubulin极性分布。
***能预防MSCs微管解聚,增强α-Tubulin在核周聚集,促进F-actin细胞前缘聚合;EMF可以部分逆转Taxol对MSCs内F-actin聚合抑制作用。
***-seq数据分析提示EMF的生物学效应与Ca2+密切相关,EMF增强SOCE介导Ca2+内流。当MSCs处于无钙环境中,EMF可以增强胞内ROCK1/2和GEFH1表达;而EMF通过SOCE介导的Ca2+内流增加会抑制ROCK1/2和GEFH1的表达,同时促进乙酰化α-Tubulin和Orail在核周聚集。
***促进Piezol表达和膜周分布,DOOKU1可降低Orail核周分布和表达,减弱EMF干预后SOCE介导的Ca2+内流;同时,DOOKU1改变了 F-actin的聚合。与对照相比较,EMF干预明显增多了 F-actin和Orail相互作用形成的Duolink点,而DOOKU1降低了 Duolink点的形成。
结论:
EMF调控SOCE和Piezol通道介导的Ca2+水平和差异性分布,改变细胞极性促进MSCs方向性迁移;在该过程中,EMF增强SOCE介导核周Ca2+升高促进微管稳定,同时抑制GEFH1-ROCK信号轴促进F-actin聚合;而Piezol通道激活可提高细胞质Ca2+梯度参与EMF增强SOCE介导Ca2+内流过程。