关键词:
脊髓损伤
脉冲电磁场
骨髓源性间充质干细胞
运动功能
神经保护
髓鞘生长
旁分泌作用
摘要:
目的:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种严重的神经损伤,通常会导致患者截瘫或四肢瘫,不仅严重影响患者的身心健康,而且给家庭和社会造成沉重的负担。目前临床上尚缺乏治疗SCI的有效方法,寻找有效、安全的SCI治疗方法迫在眉睫。脉冲电磁场(Pulsed Electromagnetic Field,PEMF)是一种非侵入式的物理因子治疗,其产生的电磁场可以透过完整组织到达深层进行作用。有研究表明PEMF对SCI有治疗作用,但其作用机制尚不明确,明确PEMF促进SCI恢复的机制具有重要的科学意义。SCI是一种复杂的多因素的疾病,单一治疗的效果通常有限,越来越多学者认为联合治疗是治疗SCI的发展方向。干细胞治疗在SCI中具有神经保护和促进神经再生的作用,其中骨髓源性间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)由于其有效性、低免疫原性、易获得性等优点在SCI治疗中展现出巨大潜力。既往研究表明PEMF可以促进干细胞的分化,可能增强干细胞治疗SCI的效果。基于此,本研究拟进一步探讨PEMF联合BMMSCs对SCI的治疗作用及其可能的作用机制,期望为SCI的临床治疗提供实验依据。
材料和方法:1.探讨PEMF治疗SCI的最适参数及治疗作用。(1)构建C57BL/6小鼠胸10(T10)脊髓损伤模型;(2)使用4种不同的PEMF参数分别干预4组SCI模型小鼠,用频率(赫兹,Hertz,Hz)和强度(特斯拉,Tesla,T)定义PEMF参数,包括5Hz,1m T、5Hz,3m T、50Hz,1m T和50Hz,3m T;(3)干预持续4周,观察PEMF干预期间小鼠体重下降程度和Basso Mouse Scale(BMS)评分,评估小鼠后肢运动功能;(4)苏木素伊红染色(Hematoxylin eosin staining,HE)观察小鼠脊髓损伤中心周围情况;(5)Masson染色观察小鼠脊髓损伤中心瘢痕面积;(6)Nissl染色观察小鼠脊髓损伤中心周围神经元数量;(7)免疫荧光观察小鼠脊髓损伤中心髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP),神经丝(Neurofilament,NF)和神经元核蛋白Neu N的表达情况;(8)免疫荧光观察小鼠脊髓损伤中心突触素(Synaptophysin,SYN)和突触后致密蛋白95(Postsynaptic density protein 95,PSD95)的表达情况;(9)免疫组化观察小鼠脊髓损伤中心血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况;(10)透射电镜观察小鼠脊髓损伤中心髓鞘修复情况;(11)蛋白免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测小鼠脊髓损伤中心周围1cm组织内NF,MBP,Neu N,PSD95和硫酸软骨素蛋白多糖(Chondroitin sulfate proteoglycans,CSPG)的蛋白表达水平。2.探讨PEMF促进SCI恢复的可能机制。(1)将各组小鼠脊髓组织进行测序,探索PEMF促进SCI恢复的相关通路;(2)WB检测各组小鼠脊髓损伤中心周围1cm组织内脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF),高亲和力原肌球蛋白相关激酶受体B亚型(Trk B),细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK),p-ERK,c AMP应答元件结合蛋白(c AMP response element-binding protein,CREB)和p-CREB的蛋白表达水平;(3)培养大鼠嗜铬神经瘤细胞PC12,过氧化氢(H2O2)刺激模拟脊髓损伤,观察PEMF对PC12神经突生长的作用;(4)培养PC12细胞,H2O2损伤,检测PEMF干预细胞后神经丝和神经元相关的蛋白表达水平;(5)培养PC12细胞,H2O2模拟损伤,检测PEMF干预细胞后BDNF,Trk B,p-ERK,ERK,p-CREB,CREB的蛋白表达水平;(6)于PC12细胞进行挽救实验,抑制Trk B或ERK或CREB,观察PEMF的治疗作用是否被抑制。3.探讨PEMF联合BMMSCs对SCI的治疗作用。(1)小鼠原代BMMSCs提取及鉴定;(2)构建C57BL/6小鼠T10脊髓损伤模型;(3)造模后对BMMSCs组和联合治疗组的模型小鼠进行干细胞原位注射(1×106个/只),其他组注射等量生理盐水;(4)干预持续8周,后续实验同1,增加水平楼梯实验,脚印分析实验(Footprint analysis),BDNF和神经生长因子(Nerve grow