关键词:
赭曲霉毒素A
适配体
无酶信号放大
CRISPR
荧光传感器
摘要:
赭曲霉毒素A(OTA)是一种主要由曲霉和青霉产生的稳定且有毒的代谢物,能够在特定环境条件下污染多种食品。其具有明显的致癌、致畸和免疫毒性,可能导致多种人类疾病,国际癌症研究机构(IARC)于1993年将其归类为2B组,即可能的人类致癌物。OTA通常以痕量存在且难以清除,会通过食品污染对人类和动物健康造成严重危害。因此,许多国家和组织已经实施了严格的OTA限制,以减少暴露量。传统的OTA检测方法,如高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)等,虽准确、可靠,但操作复杂、耗时,且需要昂贵的大型仪器。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是最广泛应用的免疫测定技术,因其高可靠性和可重复性而受到青睐。然而,它面临着耗时、抗体制备程序复杂和检测限较差等弊端。因此,迫切需要开发新型检测方法以实现OTA的高灵敏、便捷检测。鉴于此,本研究构建了基于适配体识别机理和无酶信号放大策略的OTA光学生物传感器,旨在为OTA检测和食品安全监测提供新思路和新方法。
主要研究内容如下:
1.开发了一种基于适配体(Aptamer)触发生物催化反应的比色—荧光双通道“信号开”生物传感器,实现了OTA的可视化和高灵敏检测。与现有比色—荧光双通道OTA生物传感器不同,该传感器具有一个识别过程和两个独立的“信号开”输出。具体来说,识别过程涉及Aptamer修饰于磁性纳米颗粒(MBs)表面,并与互补触发(c DNA-Trigger)序列部分杂交。在OTA存在的情况下,Aptamer与OTA特异性结合并形成G-四链体结构富集于MBs表面,同时导致c DNA-Trigger游离于上清液中。比色信号输出过程主要涉及富集于MBs表面的OTA-G-四链体复合物与氯化血红素(hemin)相互作用后催化3,3?,5,5?-四甲基联苯胺(TMB)发生颜色变化,实现OTA可视化检测。荧光信号输出过程主要涉及游离的c DNA-Trigger催化无酶DNA电路,循环放大荧光信号,实现OTA的高灵敏检测。得益于磁性富集和无酶DNA电路信号放大策略,荧光通道和比色通道对OTA的检测限(LOD)分别为0.017 p M和48.1 p M。该方法对实际样品具有高度适应性,能够成功检测葡萄汁和白酒中的OTA。此外,考虑到智能手机在全球范围内的广泛使用,我们还设计了一个具有自校正功能的小程序,辅助C通道进行OTA现场监测。
2.开发了一种基于CRISPR-Cas系统特异性识别机理和杂交链式反应信号放大策略(HCR)的比率型荧光传感器,实现了对OTA的高灵敏、高特异性检测。具体来说,识别过程涉及Aptamer修饰于MBs表面,并与互补触发(Active Trigger)序列部分杂交。在OTA存在的情况下,Aptamer与OTA特异性结合,Active Trigger游离于上清液中。游离的HCR Trigger启动Cas12a切割修饰在羧基磁球(CMBs)表面的HCR启动子HCR Trigger。切割完成后,加入发夹结构H1H2引发HCR反应,在HCR产物上修饰辣根过氧化物酶(HRP)可以催化OPD转化为DAP,由于DAP的形成,2-氨基对苯二甲酸(BDC-NH2)的信号因内滤光效应而大大减少。这种双荧光响应不仅能够实现传感的自我校正,而且还提高了检测灵敏度。在365 nm的激发波长下测得426 nm和562 nm处的荧光信号。该方法对实际样品具有高度适应性,能够成功检测葡萄汁和啤酒以及大米中的OTA。
综上所述,本研究首次通过比色-荧光双通道“信号开”模式实现了OTA的高灵敏、可靠检测,并且荧光—比色双通道可以在100 p M-10 n M范围内进行信号验证,内参型微信小程序可辅助C通道实现现场检测。CRISPR/HCR信号放大的比率型荧光生物传感器将Cas12a的高特异性、HCR的信号放大性能,以及DAP与BDC-NH2的内滤效应有效融合。本研究所构建OTA检测方法操作简便、灵敏度高,稳定性强,为霉菌毒素定量检测提供了新的思路和方向。