关键词:
DNA逻辑电路
DNA纳米组装
逻辑调控
细胞间组装
基因表达调控
摘要:
核酸分子不仅编码生命中的遗传信息,而且具有可编程性、多功能性和生物相容性等优点,随着DNA/RNA纳米技术的发展,核酸分子已被设计制造成不同的纳米结构,并应用于不同的领域。其中,基于核酸的分子电路吸引了广泛的关注。不管是在体外还是在细胞层面,基于核酸的分子电路都已经取得了巨大的进展,它们在生物传感、药物递送、疾病诊断和治疗以及合成生物学领域都表现出巨大的应用前景。在本论文中,我们充分利用DNA分子的优势,将功能核酸结构和toehold介导的链置换反应结合,分别在细胞水平以及体外无细胞水平,构建了三个不同的可编程DNA分子逻辑电路,进一步挖掘了 DNA分子逻辑电路在生物传感、控制细胞行为以及调控基因表达三个领域的应用潜力。本文的研究内容包括以下三个部分:
(1)适配体控制的多发夹级联电路用于胞外免标记生物成像。催化发夹环组装(CHA)作为DNA检测常用的信号放大方法,以及构建DNA级联电路的常用策略,存在严重的非特异性背景和信号泄露问题,限制了其进一步的应用。本章工作通过构建一个适配体制动的多发夹环级联电路,开发了一种可以有效提高CHA信噪比、降低背景泄露的通用方法。该部分工作根据靶标DNA序列,对ATP适配体变体进行筛选,并将筛选得到的ATP适配体作为制动器整合到CHA体系的第一个发夹环中,使得ATP分子成为CHA反应的条件之一,显著降低了该反应的背景信号。考虑到肿瘤组织中微酸性的环境,该工作还通过将双分子i-motif四链体作为一个开关单元引入CHA体系的最后一个发夹环中,可诱导CHA反应产物在酸性条件下发生二聚,赋予了该体系响应H+的能力。在此基础上,成功构建出三输入的AND逻辑门,在ATP、靶标DNA和H+存在的条件下,二聚产物通过与小分子硫黄素T(ThT)结合,产生荧光输出。该部分工作进一步将其应用在细胞层面,在细胞膜上实现了上述三输入AND门的构建,进而实现无标记原位生物成像。
(2)多信号响应的DNA逻辑电路用于细胞间组装的调控。目前基于DNA实现细胞间组装的常用策略是基于刚性DNA纳米结构,通过DNA杂交或识别受体的方式进行组装,该方式缺乏对生物信号的响应,尽管已有响应ATP和H+组装细胞的报道,但该方式只能响应一种生物信号,调控方式单一。在本章工作中,构建了一个多信号响应、自下而上组装的DNA逻辑电路,可响应复杂生物环境中的多种信号,实现对细胞组装的复杂调控。该部分工作设计了两个可以响应ATP分子和不同的靶标DNA的CHA反应体系,通过将17bp互补的DNA双链分别包埋在最后一个发夹环中,使得在三种信号共存的条件下,两个CHA体系的反应产物可以组装,从而构建了一个三输入的AND门。该部分工作还证明了上述CHA体系反应和组装在细胞膜上的可行性,并进一步通过将两个CHA体系分别修饰于两个细胞群,将其应用于细胞间组装,构建了一个三输入的逻辑电路,实现响应多种信号的细胞间组装的复杂逻辑调控。
(3)基于环状单链DNA的体外基因表达的逻辑调控。目前在体外,基因表达的载体主要依赖于环状或线性的双链DNA分子(质粒/PCR片段),而对于双链DNA的调控方式有限,使得难以构建更复杂的遗传回路。受启发于环状单链DNA可以在哺乳动物细胞中表达,本章工作设计了一个包含T7启动子序列和蛋白质编码序列的环状单链DNA(CssDNA),得到其对应的正义链和反义链,发现该CssDNA可以作为新的基因表达载体在基于酵母细胞提取物的体外蛋白表达试剂盒中有效的表达蛋白。该部分工作通过添加与基因表达相关的成分如dNTPs、酶抑制剂以及改变其二级结构,来实现对正义链和反义链的表达调控。此外,进一步向体系中添加酶抑制剂以及T7互补链模拟表达过程的不同阶段,通过对比正义链和反义链的表达差异,鉴定它们各自不同的表达途径。该部分工作还表明,通过与toehold介导的链置换结合,可基于CssDNA构建多种逻辑门,包括OR、NOR、INHIBIT等,实现对CssDNA基因表达的逻辑调控。