关键词：
先天性无阴道
人羊膜
阴道粘膜干细胞
组织工程技术
免疫组织化学
肝细胞生长因子
印渍技术
妇产科学
摘要：
背景:先天性无阴道是由于胚胎时期双侧副中肾管发育不全所致，近年来该病就诊人数有上升趋势。目前先天性无阴道的治疗以手术为主，术式多达20余种，但无论何种术式，都存在缺憾，如创伤大、愈合期长、阴道挛缩或闭塞、感染、植入物脱落、成功率低、人工阴道干燥或有异味、性生活不满意等。因此创建一种副作用少、创伤小、更符合生理要求的新型阴道成形术凸显重要。干细胞及生物组织工程的研究进展和应用前景，为实现这一目标提供了可能。
目的: 探讨小鼠阴道粘膜干细胞(vaginamucosastemcells，VMSCs)体外分离、培养、鉴定，及其生长的相关因素。建立人羊膜(humanamnioticmembrane，HAM)负载小鼠VMSCs生长的组织工程方法，为相关的实验研究奠定基础。
方法: 一、VMSCs的分离、培养1.利用不同时间和不同温度下的组织块培养法以及不同时间、不同酶和不同剂量下的酶消化法等培养方法对小鼠VMSCs进行原代培养。
2.多次差别消化法纯化VMSCs。
3.胰酶消化法对小鼠VMSCs进行传代。
4.冻存VMSCs。
二、VMSCs的鉴定1.倒置显微镜下动态观察VMSCs。
2.透射电镜下观察VMSCs。
***染色观察VMSCs。
4.采用免疫组织化学技术检测VMSCs中β1整合素和细胞角蛋白19(cytokeratin，CK19)的表达。
三、小鼠VMSCs培养上清中细胞因子的鉴定1.待VMSCs稳定传代后，改用无血清DMEM/F12培养基培养，第二天收集VMSCs无血清培养上清。
2.进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidedelelectrophoresis，SDS-PAGE)和Western-Blot检测，鉴定培养上清中VMSCs分泌的细胞因子。
四、HAM负载VMSCs的观察及鉴定1.0.25mol/LNH4OH处理和制备无免疫原性的HAM。
***接种在HAM基质面上并培养，倒置显微镜下动态观察细胞生长情况。
3.用HE染色及免疫组织化学技术观察及检测β1整合素及CK19的表达。
结果: 一、VMSCs原代培养及纯化、传代的结果1.不同的组织块培养法、胰酶消化培养法、胶原酶消化培养法、胰酶和胶原酶混合培养法、利用饲养层的培养法条件下均有细胞生长。胶原酶消化培养法及利用饲养层的培养法中细胞生长都很差，无法得到VMSCs。组织块培养法培养时间较长，培养出的细胞含成纤维细胞较多。单纯的胰酶消化培养法，可获取较单一的VMSCs，但细胞的生长活性与消化的时间、温度相关，时间长、温度低则活性差。只有胰酶、胶原酶混合培养法，在适当的比例和浓度时，可发挥最佳作用，获取数量多、较纯的VMSCs。在本实验中，以0.125％胰酶和0.1％胶原酶各50％的混合酶消化液消化15min体外培养小鼠VMSCs为最佳培养方法，通过此方法培养的细胞呈克隆状生长。
2.组织块培养法培养，培养出的细胞含成纤维细胞较多，需多次差别消化法纯化才能获得单纯的VMSCs，最终获取的细胞数较少。单纯的胰酶消化培养法获取较单一的VMSCs，纯化次数较少，但细胞活性相对较差。胰酶、胶原酶混合培养法在适当的比例和浓度条件下，不但纯化次数少，而且细胞活性好，可得到数量多、较纯的VMSCs。
3.原代和传代的VMSCs均呈克隆状生长，并可稳定传代5代以上。其中以0.125％胰酶和0.1％胶原酶各50％的混合酶消化培养法培养的VMSCs最佳。
二、VMSCs的鉴定结果1.倒置显微镜下动态观察体外培养的VMSCs呈克隆状生长，具有较强的自我更新能力。
2.透射电镜下观察细胞结构在形态学上表现为非成熟细胞特征，细胞较幼稚，细胞核较大，核形状多样，以圆、类圆形为主;染色质分布稀疏、电子密度较低;胞浆细胞器少，线粒体、高尔基器、内质网等不发达，未见纤维丝。
***染色显示VMSCs呈圆形或椭圆形，核大而深染、呈长圆形或类圆形，细胞较饱满。
4.从小鼠阴道粘膜分离的干细胞，β1整合素和CK19呈阳性表达。胞浆内可见棕色颗粒，细胞膜亦可着色。
三、小鼠VMSCs培养上清中细胞因子的鉴定结果***在无血清培养基培养时，VMSCs仍贴壁性能强，生长状态良好。
2.小鼠VMSCs培养上清中含有一种分子量约为84KD的细胞因子，经Western-blot方法检测，这种细胞因子就是肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)。
四、HAM负载VM
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