关键词：
棘胸蛙
嗜水气单胞菌
全基因组测序
脾脏
病理学
转录组学
摘要：
一直以来,嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的感染是制约两栖动物养殖的重要因素,而目前有关棘胸蛙（Quasipaa spinosa）感染该菌的报道并不多见,尤其针对感染后免疫器官的研究还未见报道。本论文首先从发病的养殖棘胸蛙体内分离到一株高致死的***（SZW-003）,发现脾脏是受损最严重的器官。为进一步研究该菌的致病机制,本论文对分离菌株进行了全基因组学研究。同时,为揭示脾脏在感染过程中的损伤与抗感染机制,本论文对棘胸蛙脾脏进行了正常组织结构观察、感染后的动态病理学研究与不同感染时期的转录组学分析。具体内容如下:
1.病原的分离鉴定与病理损伤观察
2019年6月,重庆石柱某养殖场的棘胸蛙出现红腿、出血及晶状体浑浊等症状并发生大量死亡,解剖后可见腹水、脾肿大及绒毛心等。从病蛙的肝中分离出一株细菌（SZW-003）,该菌具有β溶血活性,生理生化鉴定显示山梨醇、山梨糖、鼠李糖与尿素等为阴性;枸橼酸盐、甘露糖、甘露醇与V-P试验等为阳性。菌株对恩诺沙星、四环素与氟苯尼考等药物敏感;对头孢氨苄、青霉素及磺胺异噁唑等药物耐药。使用该菌株进行回归试验,结果显示分离菌能够引起健康棘胸蛙的感染,症状与自然发病棘胸蛙一致,LD50为1.59×10～6CFU/只,表明此次发病的病原为嗜水气单胞菌。病理学观察自然发病棘胸蛙,发现损伤最为严重的器官是脾脏,其次为肾与脑等。gyr B基因与16S r DNA的系统发育分析显示该菌与嗜水气单胞菌的亲缘关系最近,故结合表型特征的结果初步鉴定SZW-003菌株为嗜水气单胞菌（***）。
***-003菌株的全基因组学研究
NR注释结果与16S rDNA、gyrB基因的鉴定结果一致,确定该菌为嗜水气单胞菌（***）。在各数据库中比对发现,该菌株有300个基因与毒力衰减有关,26个基因与高毒力有关,34个基因与致病性丧失有关;共有388个毒力因子,包括LPS、荚膜多糖、鞭毛、T2SS、T3SS等;含有抗青霉素、头孢类、大环内酯类与喹诺酮类等多种抗性基因。
3.感染前棘胸蛙正常脾脏的结构与功能研究
采用组织学、免疫组织化学及透射电镜技术等方法,探索正常脾脏的结构与功能。结果显示棘胸蛙脾脏已有红髓与白髓的分化,但两者界限不清,无生发中心、椭球体周围淋巴鞘等结构。黑色素巨噬细胞中心（Melano-macrophage centres,MMCs）多见于白髓四周及内部。肥大细胞零星分布于脾内。酸性α-乙酸萘酚酯酶的检测结果为阴性。胶原纤维、网状纤维与弹性纤维在脾内均有分布。腹腔注射1%的台盼蓝,观察其在脾脏内的动态分布,结果显示1h后,红髓中游离的巨噬细胞可见蓝色信号。24h后,脾索网状细胞内的蓝色信号开始减弱。研究过程中,白髓、椭球体与MMCs内一直未见蓝色信号。同时,正常脾脏中酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）含量非常少,但腹腔注射台盼蓝后MMCs与脾索内的ACP含量表现出先升高再降低的趋势。碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AKP）的含量在研究过程中一直为阴性。心脏途径注射台盼蓝的结果与腹腔途径结果类似,仅蓝色信号提前出现了半小时。
4.感染后棘胸蛙脾脏的动态病理学研究
使用1×10～7CFU/ml的***（SZW-003）菌液腹腔注射后进行动态病理学研究,发现脾体指数出现先升高后降低的变化。组织学变化为:2h～4h,脾内轻微充血;8h～16h,被膜轻微水肿,脾内纤维肿胀,少量网状细胞变性坏死,淋巴细胞染色浑浊不清并伴有中性粒细胞浸润;黑色素巨噬细胞和小型MMCs数量增加。24h～40h,被膜肿胀,被膜下组织损伤明显;网状细胞与淋巴细胞坏死加剧,交界区红髓溶解,成熟的MMCs出现肿胀裂解。48h～72h,被膜显著变薄,被膜下可见明显的坏死带;脾实质严重坏死,白髓缩小至消失;红髓结构被破坏;纤维结构裂解,MMCs消失;4d～7d,红髓网状细胞肿胀呈气球状,少量坏死;小型MMCs增加。根据病理学变化与感染时间,将感染过程分为早期、反应期、充分发展期与耐受期。
5.感染后棘胸蛙脾脏的超微病理学研究
超微病理学研究显示,早期,网状细胞核周间隙增宽,线粒体肿胀,其内可见单个细菌;黑色素巨噬细胞增多。反应期,细胞离散,残存纤维痕迹与细胞碎片,次级溶酶体数量增加,红细胞内出现空泡结构。充分发展期,大量细胞裂解,次级溶酶体显著增多,髓鞘样结构明显;脾索纤维被破坏,血窦窦壁完整性严重受损,代谢碎片自由扩散。巨噬细胞内可见溶酶体对细菌的吞噬消化。耐受期,个别细胞坏死,总体较正常。扫描电镜显示,反应期,脾内充满形态不规则,表面出现皱褶的红细胞,红细胞表面与一些纤维上可见粘附的细菌。
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