关键词:
雏鹅
痛风
病理学观察
病毒抗原
垂直传播病原
摘要:
2015年以来,我国安徽、江苏、山东等十几个主要产鹅省区相继暴发了一种以内脏和关节腔尿酸盐沉积为显著特征的雏鹅痛风症,其死亡率高达20%~70%,降低日粮中蛋白和钙的含量并不能缓解痛风的发生,给我国养鹅业造成了巨大的经济损失。目前引起雏鹅痛风症的发生原因尚未完全清晰,虽然鹅星状病毒(Goose Astrovirus,GoAstV)被认为是临床新发雏鹅痛风症的主要病原,但用GoAstV感染雏鹅不能全面地复制痛风症,且发病程度及死亡率远不及田间自然感染病例严重,这表明其他感染因子可能与雏鹅痛风症的发生发展有关。为了评估其他可能的感染因子,本文以2018年10月~2019年7月发生于安徽地区的13例雏鹅痛风症病例为研究对象,从临床剖检、组织病理学、病原分子鉴定、病毒抗原分布等方面进行探究。在此基础上,针对痛风症发病周边地区的雏鹅来源,从垂直传播角度追踪安徽地区不同来源的鹅胚携带病原情况,以期为进一步确定雏鹅痛风症的病因提供参考依据。主要研究内容如下:1抗GoAstV衣壳蛋白ORF2多克隆抗体的制备为了解雏鹅痛风症组织中的GoAstV的分布情况,将GoAstV衣壳蛋白ORF2(1273-2115 bp)克隆至pET-32a(+)载体中,并转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经条件优化后,确定30℃条件下添加IPTG终浓度为1.0 mmol/L诱导5h,蛋白的表达量最高,获得的ORF2重组蛋白与预期大小一致(49.1 kDa)。采用His标签蛋白纯化方法进行纯化,获得重组蛋白的浓度为2.348 mg/mL。将纯化后的ORF2重组蛋白免疫昆明鼠,制备抗GoAstV-ORF2蛋白的多克隆抗体;以p GEX-4T-1-ORF2蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA检测制备的抗体最高效价为1:51200;Western–blot鉴定该抗体能够与ORF2重组蛋白发生特异性结合;IFA检测该抗体能够与连续传代感染GoAstV的LMH细胞产生特异性荧光信号。2雏鹅痛风症组织病理学观察2018年10月~2019年7月,收集安徽周边地区养殖场表现有痛风症状的雏鹅病例13例,从临床剖检、组织病理学、病原分子鉴定、病毒抗原分布等方面进行探究。剖检发现患鹅关节腔、肾脏等多组织器官出现大量尿酸盐沉积,部分雏鹅肾脏严重出血,十二指肠和回肠肿胀坚硬,外观呈“香肠状栓塞”。组织病理学发现有典型的肾脏损伤,包括肾小管坏死、上皮细胞脱落、管腔内有嗜酸性蛋白样物质;脑组织观察到卫星现象和噬神经元现象;在肝脏、肾脏、脾脏等组织中发现大量嗜碱性核内包涵体、局部可见针形呈放射状尿酸盐沉积、伴有巨噬细胞和淋巴细胞浸润;多个组织出现大量异嗜性髓细胞和异嗜性粒细胞局灶性增生。病原鉴定13个病例均为GoAstV与鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)混合感染。序列分析发现,13个病例(AH-1~AH-13)GoAstV ORF2氨基酸序列与GoAstV SD01株序列同源性较高,达98.2%~98.8%;GPV部分VP3序列与GPV标准毒株B株序列同源性较高,达96.2%~98.7%。mIHC检测可见GoAstV主要分布于肝脏和肾脏,其次是肺脏、脑和法氏囊;GPV主要分布于肝脏、肾脏、回肠及大脑。值得注意的是,GoAstV和GPV共定位于肾小管上皮细胞、肝细胞、回肠粘膜肌细胞及法氏囊滤泡上皮细胞。3鹅主要垂直传播病原的分子鉴定于2020年10~12月分四个批次收集13、20、28日龄的鹅胚和1日龄雏鹅,共计143份(均来自发病周边地区的雏鹅孵化场)进行10种鹅主要垂直传播疫病病原的分子鉴定,检测病原为大肠杆菌(Escherichia coli,***)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、GoAstV、GPV、坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)、鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)、禽肾炎病毒(Avian nephritis virus,ANV)、鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus,GRV)、4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)及鸭瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV),并对其中30枚28日龄鹅胚进行组织病理学观察及病毒抗原分布检测。结果显示,143份样品中均为单一和混合感染,单一感染12份,混合感染131份,感染阳性率分别为8.39%和91.61%;检测的病毒中GPV检出率最高,达67.13%且均为混合感染。30枚28日龄鹅胚均为多重感染,对其中四重病毒感染的鹅胚进行抗原定位检测发现GPV、TMUV、FAdV-4和GoAstV可共感染同一肾组织。综上所述,本研究制备了抗GoAstV-ORF2蛋白的多克隆抗体;安徽地区13例雏鹅痛风症病例均为GPV和