关键词:
马兜铃酸
肝细胞癌
DNA加合物
GST-P
TP53
摘要:
目的:马兜铃酸(Aristolochic acid,AA)是从马兜铃属及细辛属等马兜铃科植物中提取的硝基菲类有机酸混合物,其主要成分包括马兜铃酸I(Aristolochic acid,AAⅠ)及其去甲氧基衍生物马兜铃酸Ⅱ(Aristolochic acid,AAⅡ)。目前临床上广泛应用含有马兜铃酸成分的中药、中成药和方剂。众所周知,马兜铃酸有明显的肾脏毒性和对上尿路上皮的高致癌性,已有多项研究证实AA经还原代谢与DNA形成AADNA加合物,AA-DNA加合物蓄积可诱发基因突变,是AA致癌性研究的关键,如其可导致小鼠中宿主细胞基因(Resistance To Audiogenic Seizures,RAS)及人中肿瘤蛋白(Tumor Protein 53,TP53)基因突变,进而诱发肿瘤。但近3年来不断有文献报告称马兜铃酸与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)直接相关,引发国内外对于传统中药用药安全隐患的讨论和揣测。AA及其衍生物究竟是否可直接导致肝细胞癌的出现,AA究竟是肝细胞癌的直接致癌因子还仅充当辅助角色,起到间接的促癌作用,AA与肝细胞癌之间的相互关系和作用机理尚未完全明确。有鉴于此,本研究旨在通过使用国际通用的中期致肝癌大鼠模型(伊藤Ito模型),开展AAⅠ致癌性的量毒关系研究,探寻马兜铃酸及其衍生物的暴露是否可直接诱发肝细胞癌,科学阐明AA及其衍生物与肝癌发生(或肝脏损伤)的相关性及风险量效,明确马兜铃酸诱发及作用的靶器官,为指导监控临床用药引起的马兜铃酸致癌性提供参考依据。方法:本研究采用国际通用的中期致肝癌大鼠模型(伊藤Ito模型)和正常成年雄性大鼠,分别给予不同时间长短的AAⅠ(单次,8周,16-26周,27-52周),辅助多个检测手段来研究成年大鼠中AAⅠ暴露与肝细胞癌之间的关系,将肝脏胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST-P)阳性的肝转化灶作为肝癌前病变/增殖改变的标志物,病理学和免疫组织化学相结合通过全切片数字图像分析检测比较肝脏GST-P阳性灶数量和面积,分析增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)在肝脏转化灶中的分布和阳性率,采用DNA断裂的原位末端标记法(Terminal Dexynucleotidyl Transferase(Tdt)-Mediated Dutp Nick End Labeling,TUNEL)检测标记阳性灶内外肝细胞凋亡情况。应用高分辨率质谱检测LC-MS/MS联用分析肝、肾、胃组织中微量马兜铃酸DNA加合物(dA-AL-I)的含量。进一步利用激光捕获显微切割技术及聚合酶链反应方法(Polymerase Chain Reaction,PCR)以及Sanger测序技术,对比分析TP53基因在肝脏GST-P阳性灶内和GST-P阳性灶外突变特征和AT-TA颠换的富集情况。通过全基因组测序比对核查致癌启动基因、凋亡和坏死、染色体修饰等60余个基因及其引起的突变总数、突变的位点以及基因突变中AT-TA颠换富集情况。结果:[1]单次给予AAⅠ试验:最高剂量100 mg/kg后6周未诱导GST-P阳性灶的发生。肾脏中DNA加合物含量高于肝脏。[2]中期伊藤(Ito)模型试验(8周):在DEN+AAⅠ的各剂量组中,AAⅠ连续给药6周后剂量依赖地增加肝脏组织中GST-P阳性灶的数量及面积,其中高剂量组(10mg/kg)中GST-P阳性转化灶内TP53突变频率显著性增加,AT-TA颠换是TP53主要的基因突变形式。全基因组测序的初步分析发现,AAⅠ(10 mg/kg)可引起致癌基因IRF2、KMT2D、PCNA、STATE3、ALB、BAD、CXCR1突变频率增加,主要突变类型为C>T和A>G,但与凋亡和坏死相关的基因突变频率未出现明显改变。肾脏中DNA加合物含量高于肝脏。[3]成年雄性大鼠连续给予AAⅠ试验(52周):在联合肝脏大部切除的情况下,高剂量AAⅠ组(10 mg/kg)大鼠在16周出现死亡,而非肝切高剂量组(10 mg/kg)动物25周时出现死亡。16-26周,在肝脏大部切除的情况下,AAⅠ各剂量组(0.1 mg/kg、1 mg/kg和10 mg/kg)的死亡率分别为0%、0%和60%;27-52周,三组的死亡率分别升至20%、100%和100%。前胃鳞状上皮癌和肠道肿瘤是动物死亡的主要原因。在肝脏大部切除的情况下,AAⅠ高剂量组(10 mg/kg)在给药16周-26周诱发肝脏肝细胞坏死,诱导明显的GST-P阳性转化灶发生和肝细胞增殖性改变,1 mg/kg和0.1 mg/kg剂量下未见明显肝细胞坏死性损伤,GST-P阳性转化灶的数量和面积也较少。27-