关键词：
转氨酶
牛磺酸
磺乙醛
羟乙磺酸盐
肠道细菌
2-酮戊二酸
谷氨酸盐
X-射线(衍射)晶体分析法
摘要：
牛磺酸是人体内含量最高的氨基酸之一,其具有很多重要的生理功能,包括维持细胞的渗透势,以及用作神经递质。牛磺酸的另外一个很重要的功能是被用来合成牛黄胆汁酸。牛黄胆汁酸经胆囊分泌进入肠道,乳化食物中的脂类,在脂类代谢中发挥重要功能。牛磺酸在牛奶、肉类以及功能饮料中含量丰富。近年来,科学家深入研究并发现肠道菌的代谢产物对人体健康的影响巨大。牛磺胆汁酸在肠道内经肠道菌分泌的牛黄胆汁酸水解酶作用,释放出游离的牛磺酸,进而被肠道菌分解利用。然而牛磺酸的具体代谢过程不明。最近课题组发现了硫还原菌包括硫酸还原菌Desulfovibrio piger以及致病菌亚硫酸还原菌沃氏嗜胆菌Bilophila wathworthia等五种人体肠道菌含有全新的牛磺酸代谢途径,这些菌利用一个能催化羟乙磺酸裂解的甘氨酸自由基酶,提供亚硫酸作为这些硫还原菌呼吸作用的终端电子受体,最终产生与结肠癌和发炎反应相关的硫化氢有毒气体。沃氏嗜胆菌从头代谢牛磺酸,使牛磺酸经牛磺酸:丙酮酸转氨酶（Tpa）、磺酸乙醛还原酶（Tau F）、以及甘氨酸自由基酶Ise G顺序作用形成亚硫酸,也可以直接把细胞外的羟乙磺酸转运进入细胞内作为Ise G的底物裂解产生亚硫酸。而其它的一些硫还原菌例如Desulfovibrio piger则只能利用羟乙磺酸而不能利用牛磺酸作为呼吸作用的电子受体。自从1980年科学家就已经发现肠道内富含羟乙磺酸,是由肠道内的细菌代谢牛磺酸产生,但产生羟乙磺酸的菌,以及其生化过程完全未知。本论文首先利用生物信息学研究,发现了Bifidobacterium Kashiwanohensehans卡氏双歧杆菌含有一条可能从牛磺酸中摄取氮的完整代谢通路,其包括把牛磺酸转运进入细胞的ABC转运蛋白、牛磺酸:2-酮戊二酸转氨酶（Bk Toa）、磺酸乙醛还原酶以及把羟乙磺酸转出细胞的Isf E转运蛋白。这一科学假说可以解决科学界四十年未解决的哺乳动物肠道羟乙磺酸来源之谜。为了证明这一假说,本论文合成了卡氏双歧杆菌的Toa基因,并在大肠杆菌中重组表达,经过蛋白纯化,在体外用两种不同的偶联酶酶活检测方法以及使用高效液相-质谱联用技术（LC-MS）,证实了Bk Toa具有牛磺酸:2-酮戊二酸转氨酶的活性,其催化的转氨反应产生磺酸乙醛以及谷氨酸。我们进一步检测了丙酮酸、草酰乙酸作为氨基受体的酶活,研究发现2-酮戊二酸为最适氨基受体,而产物谷氨酸是细胞内通用氮源,这些生化实验间接地证明了卡氏双歧杆菌利用这条途径来获得细胞生长所需要的氮的假说。我们还进一步表征了Bk Toa酶,发现其催化反应的最适p H为8.0,并得到了该条件下Bk Toa的酶动力学参数(kcat=3.7 s-1,KM（taurine）=1.1 m M,KM（2-KG）=1.8m M)。这些常数支持该酶参与获取氮源的初级代谢反应。通过高通量共结晶生长条件的筛选,我们用悬滴法得到了Bk Toa蛋白与辅基5'-磷酸吡哆醛（PLP）和谷氨酸的复合晶体,我们用X光衍射方法解析了复合物的结构,分辨率达到2.7?。此前很多转氨酶的蛋白晶体结构已经被其他科研课题组解析发表,并存放在蛋白结构数据库中（protein databank,pdb）。通过对比发现我们的Bk Toa结构与这些酶结构具有很多一致特征。包括单体结构为典型的I型PLP酶折叠,以及活性中心与PLP分子相互作用的保守的氨基酸残基。然而,极为重要的是,在我们的Bk Toa晶体结构中,两个谷氨酸分子结合在活性位点附近通往蛋白表面的一个通道中,根据我们的结构,这一通道或参与底物的结合和产物的释放。更为重要的是,我们通过薛定谔软件进行的分子模拟对接实验发现了Bk Toa与牛磺酸特异作用的关键氨基酸残基:Trp 21,Arg 156在对接模型中参与和牛磺酸的磺酸基团的直接相互作用。另外,Asp 154通过盐桥稳定Arg 156与牛磺酸的磺酸基之间的相互作用。序列比对显示Trp 21,Asp 154和Arg 156在不同物种的Toa酶中都是高度保守的,而在其它转氨酶中则并不保守。这进一步证实了这些氨基酸残基赋予了Toa的酶活特异性。我们还构建并分别表达纯化了Bk Toa的W21A,D154A和R156A点突变蛋白,检测了这些单一点突变酶的酶活,发现其完全失活,这再次证明了Trp 21,Asp 154和Arg 156是Toa酶活性中心与牛磺酸特异作用的关键氨基酸残基,并可以作为鉴定其它物种Toa的关键特征,本论文关于Bk Toa的生化和结构表征,结构与功能相互关系的研究发现为未来研究牛磺酸在不同细菌中的代谢打下了重要基础。
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