关键词：
堆肥
高温菌
生物降解
生物信息学
生物化学
摘要：
堆肥高温期是堆肥材料中有机大分子破坏、断裂和分解的主要时期,也是保证堆肥无害化的重要阶段。但是由于高温的影响,高温期的微生物种群数量有限,这影响了大分子物质的降解速率。高温菌是一类能在高温下生长并繁殖的微生物群体,且大部分高温菌具有代谢快、活性高、代时短、分泌的酶热稳定性高等特点。在堆肥中接种高温菌不仅可以增加高温期微生物的数量,更可以加快难降解有机物质的分解与转化速度,从而提高堆肥效率。堆肥中的高温菌主要包括细菌和真菌,其中,细菌是最具营养多样性的生物种群,它可以分泌多种不同的酶系,负责分解大部分有机物并产生热量;真菌的耐受温度比细菌低,但对难降解物质(如纤维素、半纤维素等)的分解能力强于细菌。虽然堆体温度超过55℃后,高温真菌的生长基本停止,但其分泌的纤维素酶、半纤维素酶等仍持续存在,且其中大部分的酶在70℃仍能保持较长时间的催化活性。真菌*** Z5和细菌*** B5是本实验室从堆肥中分离出来的两株高效堆肥菌株,二者皆为高温菌,可在50℃以上的环境中生长。本文拟采用生物信息学分析与生物化学分析相结合的方法,探究二者对模拟和实际堆肥效果的影响。本研究首先采用模拟堆肥的方式,研究了在50℃高温环境下菌株Z5对小麦秸秆的分解特性,并在不同的发酵时间点取样、测定相关参数,深入解析其木质纤维降解机制。与对照相比,接种菌株Z5的处理28天后总碳相对含量减少了 22.05%,总氮相对含量增加了 76.77%,而纤维素和半纤维素含量分别下降了 36.97%和39.77%。电子扫描电镜和原子力显微镜观察结果表明,小麦秸秆表面在生物降解过程中发生了明显变化,28天后表面出现孔洞,且表面粗糙度由0.97%上升到43.83%。傅里叶红外分析显示,C-O-H与C-O-C官能团的吸收峰面积逐渐减小,说明小麦秸秆中纤维素、半纤维素类物质已经被大量的降解。X-ray结晶度分析结果表明,随着降解时间的增加,小麦秸秆的结晶度由43.8%减小到28.3%,结构逐渐变得松散。菌株Z5通过分泌多种胞外水解酶,从小麦秸秆的表面逐渐将纤维素、半纤维素等多糖类化合物分解。本实验室从堆肥样品中筛选到了一株高温细菌,结合形态学观察、理化性质和遗传序列分析将其鉴定为嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus,B5)。碳源谱实验结果表明,菌株B5可以分解利用多种有机物,包括糖类、氨基酸类、羧酸、酯类、脂肪酸等多种碳源。其生长pH为4.0-9.5,大部分堆肥材料的pH均在此范围内;其生长温度为40-75℃,最适温度为60℃,因此可在堆肥高温期快速生长。全基因组注释结果表明,菌株B5的染色体是单一的闭合环状结构,无质粒存在,基因组大小为3.37 Mb,可编码3371个基因。将菌株B5与四株已报到的纤维素酶分解菌的基因组比较发现,它们有2202个同源基因,编码类似数目的糖转运蛋白和糖苷水解酶基因,但在major facilitator superfamily(MFS)分类中的蛋白数量较高,表明菌株B5对小的可溶性物质更强大的转运能力。此外,菌株B5可编码100个碳水化合物活性酶,其中糖苷水解酶(GH)家族和糖基转移酶(GT)家族含量最为丰富,这两类酶在聚合物底物的裂解中起着重要的作用。以稻草为唯一碳源,利用转录组测序数据解析了不同温度下(40℃、60℃、70℃)菌株B5在转录水平的响应。当临近温度耐受极限时,菌株B5的热休克蛋白大量表达,它们可以作为伴侣蛋白促进压力下变性蛋白的降解,从而保护其他蛋白免受高温的有害影响。通路富集分析结果表明,高温胁迫下菌株B5蛋白质合成比较高效,这与其中的一些与细胞存活的关键酶有关,可以增强其耐受高温的能力;同时,碳代谢、脂肪酸代谢、次生代谢物合成等一些与生物过程和细胞代谢相关的基因均受不同程度的下调。降低碳的分解代谢可以节约能源,从而增强了对高温的抵抗力。菌株B5所在的土芽孢杆菌属是堆肥中广泛存在的一类高温菌属,为了研究该属在堆肥中的作用,本文对32株土芽孢杆菌的基因组进行了全面的比较分析,发现:其核心基因组包含940个直系同源基因,泛基因组含有14913个基因,属于开放型泛基因组,基因库非常丰富。COG功能分析中,氨基酸转运与代谢和碳水化合物转运与代谢分别占COG分类的12.35%和8.16%,最丰富的COG分类包括COG0477,催化各种底物的运输,如碳水化合物、脂类、多肽和其他一些分子;COG0366,编码α-淀粉酶,水解大多糖类的α键;COG0395,参与碳水化合物的吸收等。其GH家族蛋白广泛分布于各菌株,主要包括淀粉酶(GH13)、木聚糖酶(GH10)和1,4-β-木糖苷酶(GH39,GH43,GH52)。由于该属是高温菌,在堆肥高温期可以大量繁殖并分
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