关键词:
生物化学
非核糖体肽合成酶
二硫吡咯酮类化合物
蛋白纯化
酶功能
摘要:
目的:非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)是二硫吡咯酮类化合物骨架合成的关键,本研究对全霉素(holomycin)生物合成途径中的NRPS HlmE进行酶学功能研究,以期为二硫吡咯酮类化合物生物合成途径的解析奠定基础.方法:利用原核表达系统表达NRPS HlmE,并通过亲和层析方法和快速蛋白质液相层析(fast protein liquid chromatography,FPLC)纯化仪器获得目的蛋白;利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)和基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对HlmE的功能进行研究.结果:本研究成功在体外纯化得到高纯度HlmE,HPLC检测到了腺嘌呤核苷单磷酸(adenosine monophosphate,AMP)和半胱氨酰-AMP的产生,证明了HlmE中腺苷化(adenylation,A)结构域的活性;MALDI-TOF MS法证明HlmE具有挂载底物半胱氨酸的功能.结论:本研究纯化得到的NRPS HlmE可以活化并挂载底物半胱氨酸,为进一步研究NRPS的功能以及深入研究二硫吡咯酮类化合物的生物合成途径奠定基础.