关键词：
Mormyrid电鱼
电感受器
颗粒细胞
重合检测(coincidence detection)
非线性相加(non-linear summation)
房室模型(compartmental model)
缝隙连接
连接子36
Western blot
免疫组织化学
脑片膜片钳
摘要：
来自南美洲和非洲的一种淡水电鱼Mormyrid,有着非常发达的小脑和小脑样结构。Mormyrid不仅在尾部有一个能连续放电的电器官（electric organ）,而且在身体表面皮肤分布有大量的电感受器（electroreceptors）。因此,这种电鱼的电感受器可以感受由自身电器官发出的分布于电鱼身体周围的电场强度,并将外周信息精确传入中枢,以利捕获猎物、逃避天敌、以及和同类个体之间进行信息交流。这种特殊的信息传导通路,使得Mormyrid成为研究感觉信息传入通路和运动信息传出通路的理想模型之一。
电感受器的传入神经纤维终止于电感受叶（electrosensory lobe,ELL）、亦即小脑样结构的表层和深层的颗粒细胞,颗粒细胞继而把信息传向Purkinje-1ike（P-Li）细胞。迄今为止,对颗粒细胞的传入神经通路和颗粒细胞的下一级结构P-Li细胞的研究已较详尽,但对颗粒细胞本身的生理特性以及颗粒细胞对传入信息的处理和整合机制,却知之甚少。电镜研究表明,电感受器传入神经纤维和颗粒细胞之间的联系方式为混合性电突触和化学性突触。在体电生理实验表明,随着刺激强度的增加,电感受器传入神经纤维上的动作电位数量随之增加,而且更为敏感的是缩短了从刺激开始到第一个动作电位发生的潜伏期时程。这表明,感觉传入神经可以通过动作电位的数目,特别是通过第一个动作电位发生的潜伏期长短来编码外周环境的刺激强度。那么,颗粒细胞又是通过什么样的解码机制把传入神经纤维上携带的、反映周围环境变化的信息传递给高一级的中枢呢?过去的研究表明,颗粒细胞在通过感受器接受外周传入信息的同时,也接受由中枢下传的参考信息。外周的传入信息与电鱼周围电场强度和电流密度的改变密切相关,而来自中枢的参考信息则作为指令性信号传递给颗粒细胞。颗粒细胞把外周传入信息与来自中枢的指令信息进行比较、整合,进而向高级中枢进行传递。由此可见,颗粒细胞是研究重合检测（conincidence detection）的一个非常重要的靶点,而这也是我们对颗粒细胞感兴趣的重要原因之一。同时,以往的电生理记录和电镜研究均提示,电鱼脑内广泛分布着电突触（electric synapse,即ephapse）,但对组成这些电突触的连接子（connexin）蛋白的组成情况却知之甚少,有待进一步深入探讨。
本课题采用可视情况下的脑片全细胞膜片钳技术、注射生物素（biocytin）、神经生物素（neurobicytin）标记细胞、以及染色耦合（dye coupling）技术,并通过建立传入纤维和颗粒细胞之间的电突触联系的计算机模型,对电鱼电感受叶颗粒细胞的形态特征、电生理特性、和突触反应,进行了较详细的观察,以揭示颗粒细胞在电感受传入通路中对外周信息的解码机制,及其在整合传入信号过程中进行精确时间编码（temporalcoding）和重合检测时所起的作用。同时,实验还利用特异性标记神经系统电突触连接子Connexin-36的抗体,用免疫细胞化学和Western blot等技术,分析电鱼Mormyrid脑内构成电突触的连接体（connexon）的分子组成和电突触的分布情况;并用一些束路追踪（tract tracing）手段,对mormirid电感受叶中的神经环路组成作了进一步阐明。
第一部分:电感受叶颗粒细胞对电感受传入纤维动作电位的发生和幅度调控的脑片膜片钳研究
本实验主要采用全细胞脑片膜片钳技术,对电鱼Mormyrid小脑电感受叶表层和深层颗粒细胞的电生理特性进行了详细研究。实验主要步骤包括麻醉、取脑、切片和电生理记录。脑片用振动切片机制备,厚度为160～250μm,在脑片孵育槽中孵育30分钟后,转入脑片记录浴槽;在红外相差显微镜观察下,通过电刺激器刺激后侧线神经（posteriorlateral line nerve）引发传入冲动;在电流钳或电压钳模式下,记录突触后颗粒细胞产生的兴奋性或抑制性突触后电位/电流（EPSP/IPSP或EPSC/IPSC）,经数据采集和膜片钳放大器放大后,用PCLAMP8软件进行分析处理;电生理记录结束后,作细胞内或细胞外注射生物胞素或放置其它示踪剂,准备以后作颗粒细胞的形态及其突起投射情况的观察。实验结果显示:
1.细胞内或细胞外注射Biocytin进行细胞标记后均可见,表层颗粒细胞胞体直径约3～5μm,有丰富的底树突,轴突可投射至神经节细胞层（ganglion layer）或分子层底层;深层颗粒细胞胞体直径约5～7μm,只有少量的底树突,其轴突仅投射至网状层（plexiform layer）或神经节细胞层基底部,深层颗粒细胞轴突起始部位较细,离开胞体10～20μm后突然加粗,末端呈爪样分布;放置在切断的神经断端的Neurobiotin进入到
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