关键词:
Wh6株弓形虫
包囊
神经病理变化
星形胶质细胞
碱性热休克处理
摘要:
背景弓形虫穿过血脑屏障进入中枢神经系统引发脑部的免疫反应,最终以组织包囊的形式在中枢神经系统长期存在,存在于脑部的弓形虫包囊可以通过多种途径引发神经病理变化,从而影响宿主行为,并与宿主精神疾病的进展密切相关。目的本文旨在探究慢性感染阶段,Wh6株弓形虫包囊的时空分布对于脑部炎症的神经病理学影响;以及弓形虫感染对于星形胶质细胞功能的影响。方法1.体内实验:通过包囊灌胃制备弓形虫感染小鼠模型,监测时间为感染后第10、30、60、90、120和160天,监测的感染区域为小鼠海马-下丘脑、前额叶、纹状体和小脑。使用弓形虫灌胃感染小鼠后,在各个监测时间点,对小鼠症状病情进行评分;取感染小鼠脑组织切片后,用免疫组织化学法追踪标记包囊,记录包囊在小鼠脑部各区域的时空分布;HE染色观察并记录各感染区域的神经病理变化;处死小鼠后完整分离出小鼠脑部各区域的组织,镜下对弓形虫包囊进行计数,并统计记录各个监测时间点的包囊平均直径。2.体外实验:使用碱性热休克处理诱导弓形虫速殖子向缓殖子转化,在体外实验中模拟弓形虫中枢神经系统急性感染向慢性感染阶段的转化,监测时间为共培养后第1、3、5和7天。在各个监测时间点,提取总RNA后用Real-time PCR方法监测SAG1(速殖子抗原1)与BAG1(缓殖子抗原1)的表达动态记录感染阶段的转变;使用蛋白质免疫印迹法监测p50、p65和STAT3分泌的变化反应星形胶质细胞炎症通路NF-κB和STAT3激活情况;取上清液后用ELISA实验监测炎症因子(IL-1β,IL-12,TNF-α)分泌的动态变化;提取总RNA后用Real-time PCR方法监测星形胶质细胞促突触形成相关基因GPC4与GPC6表达的动态变化。结果1.体内实验:1)弱毒株Wh6株感染小鼠后,在第10~30天监测到小鼠症状病情逐渐加重,死亡数量最多,多数小鼠出现多个系统症状,少数出现中枢神经系统症状;在第30~160天,感染小鼠各系统症状逐步好转;至第120天几乎所有小鼠恢复正常生理状态,但部分遗留中枢神经系统症状。2)通过免疫组化追踪显示,在各个监测时间点,弓形虫包囊在小鼠各区域脑组织的分布存在差异,以海马-下丘脑区域为多,前额叶和纹状体次之,小脑最少。3)HE染色切片观察发现,在慢性感染期间,小鼠脑部弓形虫包囊附近出现神经炎症的特异性病理表现;第10~30天,观察到弓形虫包囊引发的脑部微血管炎症逐步加重,包囊“卫星分布”现象也增多,在第30~160天,脑部微血管炎症缓慢恢复,其中在第90~120天,包囊噬神经性现象与“卫星分布”现象增多至次级峰后再次下降。4)随着感染天数的增加,在小鼠脑部各区域的包囊直径均有增长趋势;在各个脑组织区域,包囊数量在第10~30天上升至顶峰随后逐渐减少,在第90~120天再次上升至次级峰后逐步下降。2.体外实验:1)Real-time PCR监测发现,至诱导后共培养第5天,弓形虫基本完成速殖子向缓殖子的转化,即感染急性期向慢性期的转化。2)蛋白质免疫印迹法监测发现,在体外模拟的急性感染阶段,NF-κB通路特定蛋白IκB和p65激活呈逐渐增强趋势,而STAT3通路特定蛋白的激活基本保持不变;在体外模拟的慢性感染期间,NF-κB通路的激活以p65的表达增多为主,IκB仅轻微增加,而STAT3通路特定蛋白的激活呈轻微的下降趋势。3)ELISA监测发现,在体外模拟的急性感染阶段,星形胶质细胞分泌的IL-1β呈下降趋势,IL-12呈上升趋势,TNF-α的分泌量几乎不变,感染转化为慢性阶段后,IL-1β与TNF-α呈较缓下降趋势,而IL-12大幅下落。4)Real-time PCR监测星形胶质细胞形成突触功能发现,在体外模拟的弓形虫急性感染阶段,GPC4与GPC6 mRNA的表达逐渐受到抑制,而当感染进入慢性阶段后,GPC4与GPC6 mRNA的表达有恢复迹象。结论本研究发现,慢性感染期间弓形虫包囊在感染小鼠脑部的时空分布可以引起神经病理炎症变化对其产生行为和精神症状有一定的促进作用;且慢性感染期间,弓形虫会降低星形胶质细胞的炎症反应,但可恢复星形胶质细胞突触形成功能。图[15]表[7]参[95]