关键词：
遗传性心律失常
离子通道病
Brugada综合征
基因突变
诱导多能干细胞
摘要：
目的：
研究钠通道β1亚基新的突变A197V在Brugada综合征发病中的意义。在体外细胞系HEK293水平共转钠通道α亚基SCN5A与突变β1亚基,通过全细胞膜片钳技术明确SCN1B/A197V对钠通道电生理学特性的影响。建立基于患者特异性的诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs),为心肌分化、电生理研究及基因治疗提供基础。
方法：
1.临床明确诊断的10例Brugada综合征患者进行6种编码基因的测序,以发现与该病相关的新的基因位点突变。
2.构建基于突变的表达质粒,并通过酶切及直接测序证明质粒构建的成功。
3.将含突变基因的质粒转染HEK293细胞,进行细胞免疫荧光鉴定及膜片钳技术检测,以明确该基因突变位点对离子通道特性的影响。
4.原代培养患者皮肤成纤维细胞,使用Yamanaka的SKOM(SOX2、KLF4. OCT4、C-MYC)四质粒系统感染皮肤成纤维细胞,在特定的培养条件下诱导生成基于患者特异性的iPSCs。
结果:
1.基因测序结果表明其中一位具有Ⅰ型Brugada综合征心电图的46岁患者发现编码钠通道β1亚基的SCN1B第4外显子发生突变,造成197位的丙基酸A被缬氨酸V取代,即A197V突变。该突变目前尚未被报道。
2.通过定点诱变技术成功构建了含有A197V突变的表达质粒,并经过酶切和直接测序验证了突变点构建成功,且未造成编码区其他碱基改变。
3. SCN1B/A197V的突变质粒和SCN1B/WT,分别和SCN5A/WT共转HEK293细胞,以及单转SCN5A/WT,三组细胞相比较。在细胞免疫荧光中发现,Nav1.5蛋白主要定位于细胞膜部分,但相比较SCN1B/WT,A197V突变组Navl.5蛋白分布特点并未显示出明显差异。SCN5A/WT+SCN1B/A197V组相比较SCN1B/WT组和单转SCN5A/WT电流密度及幅度明显减小,电流激活提前,激活速度减慢,失活速度有一定的减小,且窗电流增加。这些特点均证实了SCN1B基因A197V突变降低了钠通道功能,增加了通道的不稳定性,从而容易促使心律失常的发生。
4.成功原代培养患者皮肤成纤维细胞,SKOM四质粒系统感染细胞后,经过特定培养条件诱导出形态典型、边界清楚、呈干细胞克隆样生长的iPSCs,从而为进一步建立患者特异性的Brugada综合征疾病模型奠定基础。
结论：
1.钠通道β1亚基新的突变A197V可能通过降低钠通道的功能而导致Brugada综合征的发病。
2.利用Yamanaka的SKOM四质粒系统在特定的培养条件下,可成功建立患者特异性的iPSCs细胞系,为疾病模型的进一步研究提供条件。
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