关键词：
急性心肌梗死
NLRP3炎性体
胚胎干细胞
内皮化
小口径组织工程血管
摘要：
21世纪初,全球约1700万人死于心脑血管疾病,预计到2025年死亡人数将达到3000万人[1]。其中,急性心肌梗死的致死率最高,针对心梗后心肌细胞的损伤及其主要病因动脉粥样硬化,科学家们提出不同的解决方案,取得了显著成效。但最终,血管移植仍然是解决这一难题不可或缺的有效手段。据统计,每年全球大约超过60万人需要进行血管外科手术,血管移植是临床治疗血管疾病（如动脉粥样硬化、动脉瘤、先天性血管畸形）及外伤性血管损伤等的主要手段[2]。自体动脉和自体静脉是较理想的动脉移植物,但人体自身可供移植的非必需血管的来源、长度和直径范围都极为有限。异体血管移植存在的免疫排斥反应和其他术后并发症等问题尚未解决[3]。小口径组织工程血管有着广泛的临床需求。内皮细胞作为血管的主要功能细胞,可以合成和分泌多种血管活性因子,调节凝血和抗凝,改变血管的通透性,促进营养物质交换和代谢,并且,可以调控平滑肌细胞的功能,维持血管的舒缩平衡[4,5]。已有研究表明,血管内腔内皮细胞层的存在,形成了血管壁屏障,是抑制血栓形成和内膜增生的关键因素。人体自身的内皮细胞功能完善,没有免疫原性,但是原代细胞提取、培养、扩增的问题都难以解决[6]。而胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能[7],理论上,可以产生足够数量的血管细胞（血管内皮细胞、平滑肌细胞）满足临床和科研的需求。所以,胚胎干细胞作为内皮细胞的来源,具有广阔的应用前景[8]。血栓和内膜增生发生的另一个重要原因就是炎症反应。小口径组织工程血管植入体内后,引发急性炎症反应,加速了血栓的发生和发展。并且,炎症刺激平滑肌细胞异常迁移和增殖,级联反应募集了更多的炎性细胞,导致组织工程血管出现内膜增生[9,10]。炎症反应是一把双刃剑,适当的炎症可以促进组织工程血管体内重建[11],但是不可控的炎症反应却极大的影响了组织工程血管的长期通畅。NLRP3炎症小体的激活是炎症反应的关键阶段,因此,我们想通过小分子抑制剂MCC950抑制炎性小体[12],调节炎症反应,改善局部微环境,实现小口径组织工程血管的在体重建和长期通畅。我们将胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞,通过体外种植技术,实现组织工程血管的内皮化。接着,通过自组装技术,将小分子抑制剂MCC950修饰于血管外膜,发挥抗炎功能。体内移植后,内皮细胞分泌活性因子,抑制血栓形成和内膜增生。小分子抑制剂调控炎症反应,改善局部微环境,促进组织工程血管重建,最终实现组织工程血管的长期通畅。方法:1、靶向递送小分子抑制剂MCC950首先,我们以最常见也是最严重的心血管疾病,急性心肌梗塞作为动物模型,研究小分子抑制剂MCC950的炎症调控功能,并观察是否对心血管功能恢复产生影响。为避免局部注射的二次损伤,我们采用靶向递送的方式。设计靶向递送系统,装载MCC950。粒径分析及透视电镜对材料进行表征,缓释及酶响应实验测定递送系统的效率。活体荧光成像观察药物递送系统的靶向能力。通过超声、Masson染色、HE染色观察心梗治疗后心功能的恢复情况。2、胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞培养胚胎干细胞,并进行稳定扩增。免疫荧光染色观察ESC多能性因子的表达情况。采用改善的诱导分化方案,将ESC分化为血管内皮细胞。免疫荧光染色,Weston blot,RT-q PCR,检测内皮特异性marker的表达情况。流式细胞分析术检测诱导分化效率。小管形成实验验证诱导内皮细胞的生物学功能。3、构建MCC950修饰的内皮化小口径组织工程血管并进行体内移植运用自组装技术,将MCC950修饰于脱细胞血管基质的外膜,通过扫描电子显微镜进行表征。诱导内皮细胞种植于血管内腔后,通过扫描电镜、HE染色观察种植情况。功能化小口径组织工程血管体内移植后,通过超声、CTA、HE染色、免疫荧光染色,观察血管移植物的通畅情况、炎性细胞浸润情况以及血管重构情况。结果:1、TEM和粒径分析表明,药物递送系统构建成功,大小均一、形态一致。缓释及酶响应实验表明,MCC950装载稳定,酶响应情况良好。活体荧光成像显示MCC950高效递送到心梗区域。超声、masson染色、HE染色结果表明,MCC950可以抑制炎症小体的功能,保护心肌细胞免受进一步损伤,恢复心脏功能。2、胚胎干细胞可以高效分化为血管内皮细胞。免疫荧光,免疫蛋白印迹及q PCR结果显示,诱导内皮细胞表达CD31/CD144/v WF等内皮细胞特异性标志。流式细胞分析结果显示,CD31/CD144双阳性细胞达到90.5%。诱导内皮细胞具有稳定成小管的能力。3、TEM及HE检测显示,体外成功实现了组织工程血管的内皮化,并将MCC950修饰到了血管外膜表面。体内移植1个月后,MCC950修饰的内皮化小口径组织工程血管通畅良好,对照组出现了狭窄和堵塞。免疫荧光染色及HE染色显示,实验组炎症
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