关键词：
子宫
细胞培养
三维组织构建
胚胎共培养体系
植入模型
摘要：
子宫是雌性动物的重要生殖器官,有关子宫生理及病理机理的研究可促进发育生物学及生殖医学的发展。但子宫随雌性动物的发情周期在形态及生理方面呈动态变化,因而在体内研究具有一定的局限性。本研究利用细胞三维培养技术,将假孕母兔的子宫内膜上皮细胞、基质细胞以及子宫平滑肌细胞在体外分离培养后,以Ⅰ型液态鼠尾胶原为支架,按自然子宫的结构在体外重建含子宫平滑肌层、基质层和上皮层的三维组织片层结构模型,同时将构建组织与小鼠两细胞期胚胎及囊胚共培养后观察其对早期胚胎发育以及胚胎植入的影响,以期为发育生物学、生殖生理学及病理学研究提供一个体外模型。 本研究结果如下: 1、研究子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外分离方法和增殖规律的结果表明,家兔在经过促情激素（PMSG）和促排卵激素（hCG）处理后分离其子宫内膜上皮细胞和基质细胞,可在体外增殖生长。利用0.1%胶原酶对兔子宫内膜进行消化并用离心法分离可获得较好的分离培养效果。培养液中添加雌二醇（E2,100 nmol/L）和少量孕酮（P4,10 nmol/L）对上皮细胞增殖有促进作用,添加孕酮（P4,100 nmol/L）对基质细胞的体外增殖有促进作用。免疫组织化学染色表明,培养的上皮细胞对上皮角蛋白抗体呈阳性,基质细胞对波形蛋白抗体呈阳性,说明性腺激素不会促使子宫内膜细胞在体外分化为其他类型细胞。上皮细胞与少量基质细胞（15%）共培养并辅以100 nmol/L雌二醇和10 nmol/L孕酮可促使上皮细胞在体外传4-5代。子宫内膜细胞在体外的大量增殖可为子宫组织的体外三维构建提供足量的种子细胞。 2、研究子宫平滑肌细胞体外增殖规律的结果表明,应用组织机械剪碎胰酶消化方法可成功地进行子宫平滑肌细胞的体外培养和传代。子宫平滑肌细胞在体外的增殖受卵巢性腺激素的影响,100 nmol/L的E2对子宫平滑肌细胞有显著的促增殖作用,而100 nmol/L的P4则对其增殖有显著的抑制作用。体外培养的子宫平滑肌细胞在激素作用下仍可维持其特性,对α-平滑肌肌动蛋白抗体呈阳性反应。利用本实验方法分离培养的子宫平滑肌细胞可用于有关子宫平滑肌生理的研究,也可为构建子宫三维结构提供充足的种子细胞。 3、以体外培养扩增的子宫内膜上皮细胞、基质细胞和子宫平滑肌细胞作为种子细胞,以浓度为1.8 g/mLⅠ型液态鼠尾胶原作为支架材料,Matrigel作为促细胞生长物质,构建了包括子宫上皮层、基质层和平滑肌层在内的子宫三维片层的体外模型。H.E染色结果表明构建组织具有类似于自然子宫的三维三层结构。免疫组织化学染色表明构建组织的三层结构分别对上皮角蛋白抗体、波形蛋白抗体和α-平滑肌肌动蛋白抗体呈阳性反应,说明三层组织分别来源于子宫内膜上皮细胞、基质细胞和子宫平滑肌细胞。透射电镜检测证明在构建组织中,上皮细胞极化为柱状排列,细胞之间建立了紧密连接和桥粒结构,细胞中线粒体数量丰富、形态正常。扫描电镜对激素处理的三维片层的检测结果表明,构建组织的上皮细胞表面有微绒毛和纤毛存在,一些微绒毛特化为Pinopode结构。与胚胎植入有关的一些标记性基因β3-整合素、HOXA-10以及肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）的RT-PCR结果表明,三个基因在性腺激素处理后的子宫三维片层中均有显著表达,而未用激素处理组则不表达或表达很微弱,说明构建组织具有自然子宫的一些生理功能。应用本实验方法构建的子宫三维片层结构具有与自然子宫类似的结构和功能,可为与子宫有关的病理及生理机理的研究提供了一个较为理想的体外模型。 4、将体外构建的子宫三维组织片层结构与小鼠两细胞胚胎共培养以建立三维共培养体系,观察其对胚胎早期发育的影响。结果表明,相对于培养液单独培养、输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞共培养体系,子宫三维组织共培养体系可极显著或显著提高小鼠两细胞胚胎的囊胚发育率、囊胚贴附率以及囊胚细胞数,囊胚发育率分别提高82.3%,34.6%和24.5%,囊胚贴附率分别提高273%,65.8%和63.2%,囊胚细胞数分别提高47.8%,19.3%和23.6%。说明子宫三维组织共培养体系可以在体外为胚胎发育提供一种更类似于体内的环境,有利于胚胎的体外囊胚发育率和发育质量的提高。 5、将构建的子宫三维组织片层与小鼠囊胚共培养以观察其能否作为胚胎植入现象的体外研究模型。结果表明,将该片层用性腺激素处理后与小鼠囊胚共培养,大多数囊胚可顺利脱带,黏附在子宫三维组织片层表面,最后穿过上皮层植入到基质层。植入的胚胎可在构建组织中进一步发育,并观察到微管样结构形成,表明胚胎在子宫三维片层上的发育可能启动了囊胚内细胞团的第一次分化。因此,利用本方法在体外构建的三维子宫组织片层可作为探索体外胚胎植入以及囊胚内细胞
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