关键词：
藏鸡
白来航E系
低氧
RNA-seq
iTRAQ
差异表达
摘要：
高海拔地区寒冷、缺氧的自然条件会影响动物胚胎的生长发育。禽类的胚胎在体外发育,对环境变化尤为敏感,孵化率随着海拔升高而降低。低氧环境会造成鸟类胚胎发育速度减慢、孵化时间延长、孵化率下降。不同品种的鸡胚胎对低氧环境适应能力具有品种差异性。为研究不同品种鸡胚低氧发育的调控机制,本研究分别采用常压低氧、低压低氧测定不同鸡品种的种蛋胚胎死亡率、器官发育等表型指标,并采用高通量测序技术分析鸡胚胎心脏组织转录组、蛋白质组学,筛选与低氧适应表型相关的基因和调控通路,为进一步探讨鸡胚胎低氧适应的分子机制提供基础。 收集藏鸡(TC)、茶花鸡(CH)2个品种种蛋分别进行常压常氧(21%O2)、常压低氧(13%O2)孵化试验并测量胚胎重、胚胎器官重、孵化率等表型指标,结果显示：低氧会造成胚胎大量死亡,并且低氧下茶花鸡死亡率大于藏鸡,低氧孵化的D16开始出现死亡高峰期;通过分析低氧和常氧下的胚胎器官发育变化,发现心脏和大脑对缺氧最为敏感。 收集藏鸡(TC)、白来航E系(WL-E)、茶花鸡(CH)、白来航D系(WL-D)、拉萨白鸡(LWC)、北京油鸡(BY)6个品种种蛋分别进行常压低氧(13%02)、低压低氧(3000m海拔)孵化实验,测量胚胎重、胚胎器官重、孵化率等指标,并采集胚胎血液进行血红蛋白浓度等血液学指标测定。结果显示：WL-E、TC、LWC均具有良好的低氧适应性,但适应机制并不完全相同,并且在低氧下各品种鸡胚器官发育具有品种特性。胚胎发育期低氧适应品种的血红蛋白浓度、红细胞数、红细胞压积均高于低氧不耐受品种。在本试验中首次发现白来航E系低氧孵化率较高,并且接近甚至超过藏鸡。 收集藏鸡(TC)、茶花鸡(CH)、藏鸡(?)×茶花鸡(?)(TC×CH)、茶花鸡(?)×藏鸡(?)(CH×TC)种蛋进行低氧(13%O2)孵化。结果显示种蛋的蛋重、孵化期失水率主要由母本决定;茶花鸡与藏鸡的杂交种蛋低氧孵化率显著提高,表现较强杂种优势,但正反交组间种蛋低氧孵化率差异不显著：藏鸡作为母本的种蛋低氧孵化胚胎发育前期优于藏鸡作为父本组,后期则藏鸡作为父本的种蛋胚胎发育能力较好。 采集TC、CH、WL-E、WL-D低氧孵化D16的胚胎心脏组织,提取总RNA进行RNA-Seq分析,按照P≤0.05且差异表达倍数大于2倍以上的标准选取差异表达基因,将得到的差异基因在DAVID网站上进行GO注释,并用GSEA法分析差异富集的pathway通路。在转录组学分析中,每个样品测序得到不少于4G数据,基因组Mapping率83%以上。经计算,在低氧孵化D16鸡胚胎心脏组织中阳性表达基因18467个,其中4组共享表达16340个。TC与CH间差异表达基因共354个,其中上调表达130个,下调表达224个。TC与WL-D间差异表达基因516个,其中上调表达292个,下调表达224个。WL-E与WL-D间差异表达基因432个,其中上调表达294个,下调表达138个。WL-E与CH间差异表达基因384个,其中上调表达206个,下调表达178个。TC与对照的低氧不适应品种组(CH和WL-D)的差异基因62个,主要富集在heart development(心脏发育)、blood vessel development(血管发育)等GO term中：WL-E与对照组(CH和WL-D)组的差异基因64个,主要富集在neurotransmitter receptor activity(神经递质受体活性)、GTP binding(鸟苷三磷酸结合)等。TC和WL-E虽然都具有低氧适应性表型,但与不适(应组的共有差异基因只6个,其中3个基因是HSP90AA1、BEAN1、GBP,其余3个为未注释基因。TC特异Pathway主要集中在HIF通路上下游,如mTOR signaling pathway、MAPK signaling pathway等;WL-E特异Pathway主要集中在能量代谢途径上,如TCA cycle等。 采集TC、CH低氧孵化D16的胚胎心脏组织,提取总蛋白进行iTRAQ分析,差异表达蛋白筛选标准为P≤0.05且差异表达倍数大于2倍。将得到的差异蛋白在PANTHER网站上进行GO、 COG、pathway注释。在iTRAQ蛋白组学分析中,发现低氧孵化的藏鸡与茶花鸡共有118个差异表达蛋白,藏鸡上调表达46个,下调表达72个,富集在HIF调控通路、血管生成通路等,主要有EGLN1、MAP2K2等差异表达蛋白。 本研究通过不同品种鸡胚的低氧孵化表型及转录组、蛋白组学的分析,得到胚胎低氧敏感器官、不同适应表型以及差异表达的基因、蛋白,能够为胚胎低氧适应的的分子机制研究提供新思路和线索。
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