关键词:
APCM
组织工程角膜支架
生物材料角膜缘上皮细胞
角膜内皮细胞
胚胎干细胞
细胞分化组织工程
三维培养
角膜
组织工程全厚角膜
穿透性角膜移植
摘要:
角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位,全世界超过1000万人因为角膜疾病而致盲。目前,对于角膜盲患者来说,角膜移植仍然是唯一确切有效的治疗方法。但是因为目前捐献的角膜材料严重缺乏,而使很多因角膜疾病而致盲的患者很难获得及时而且有效的治疗。因角膜供体缺乏,我国每年实施手术的病人还不到4000例,而每年需行角膜移植的患者却达到约30万。在这种情况下,人造角膜替代品成为了当前研究的热点。人工角膜(Keratoprosthesis)虽然已被批准应用于临床,但因生物相容性差、术后并发症多,难以在临床上推广。组织工程角膜(Tissue-engineered cornea,TECs)角膜是将体外培养的角膜细胞接种于可降解的生物支架材料上构建的与天然角膜具有相似的功能和结构的角膜替代物。因为其生物相容性具良好的,而受到了广泛的关注。角膜组织工程在近几十年来研究取得了较大进展。脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)及重组的人胶原在临床或实验动物前板层角膜移植中取得良好效果。但对于多种角膜疾病来说,如圆锥角膜、角膜穿孔等,穿透性角膜移植仍是广泛应用的手术方式。由于传统观念的影响,在我国角膜捐献率较低,而角膜屈光手术的开展使适于穿透性移植的角膜供体进一步减少。构建组织工程全厚角膜植片是解决当前穿透性角膜移植供体不足问题的可行的方法。此外,角膜所包含的细胞类型相对较少,主要有内皮细胞、上皮细胞和角膜基质细胞。相对于其他器官来说,构建TECs角膜更简单、易行。TECs的两个关键成分是种子细胞以及其支架材料。脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)具有正常角膜的关键特性,如良好的透明性和生物相容性、与天然角膜相似的力学特性、低免疫原性、可耐受手术缝合等。对于TECs的构建来说,其是一种良好的支架材料。此外,猪角膜来源非常广泛。所以,在本研究中我们拟选用已经脱除了细胞的猪角膜基质(脱细胞猪角膜基质(Porcine cornea matrix,PCM)作为组织工程全厚角膜的支架。以往文献报道APCM在基质囊袋植入术后可维持一年不降解,且角膜基质细胞在移植术后3周可迁入其内。鉴于此,角膜基质细胞在组织工程全厚角膜构建中未接种。但猪角膜的厚度大于人角膜,经脱细胞程序后,其厚度进一步增加,而植片与植床厚度不匹配可影响角膜移植术后切口的愈合。因此,在以脱细胞猪角膜为支架的组织工程全厚角膜的构建中,如何制备与天然角膜厚度相似的脱细胞猪角膜片层是首先需要解决的问题。种子细胞作为构建TECs中的又一关键成分,需要具备来源广泛、可在体外大量扩增等特点。但原代培养的人角膜上皮和内皮细胞增殖能力有限,而经基因转染的角膜细胞系具有潜在的致瘤性,限制了其临床应用。胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)因具有强大的增殖能力和分化全能性,可向机体三个胚层的细胞分化,近年来成为组织工程中种子细胞的一个重要的来源。在我们前期研究中已建立了人胚胎干细胞在体外向角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞的诱导分化的方法。诱导的角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞与原代培养的细胞具有相似的形态和功能,可作为TECs的种子细胞的来源。角膜的上皮细胞和内皮细胞分别位于角膜前后两面。因此,为了模拟正常角膜结构,建立一个可于支架前后两面同时培养细胞的三维培养方案也是函待解决的问题。综上所述,在本研究中,我们首先开发了一个可制备与天然角膜厚度相似的APCM支架的切割工具。其次,建立了可用于APCM前后两面同时培养细胞的三维培养方案。并通过该培养方案将胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样(Limbal epithelial cell-like,LEC-like)细胞和角膜内皮样(Corneal endothelial cell-like)细胞作为种子细胞接种于APCM支架尝试构建组织工程全厚角膜,探讨该培养方案用于构建组织工程全厚角膜的可行性。本研究发现制备的脱细胞猪角膜支架与天然角膜具有相似的厚度和生物力学特性。以其为支架,通过我们建立的三维培养方案构建的组织工程全厚角膜与天然角膜相似,可形成复层的上皮和单层的内皮,且分别表达角膜上皮和角膜内皮细胞标记物。TECs内皮细胞的密度和生物力学特性也与天然角膜相似,并在体内表现出一定的功能。但是该植片的透明度与天然角膜相比仍存在一定的差距,还需要在以后的研究中进一步改进。第一部分APCM支架的制备[目的]探讨使用我们自行设计的APCM切割工具制备的APCM片层是否可用作组织工程全厚角膜的支架。[方法]1.猪角膜脱细胞程序:首先新鲜的猪眼球放置于超净工作台中,使用含1%青霉素与1%链霉素的高温灭菌的PBS充分洗涤。使用角膜穿刺刀和角膜剪取下角膜