关键词:
创伤后应激障碍
杏仁核
CACNA1C
L型钙离子通道
恐惧
摘要:
目的:创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder,PTSD)是指受到异乎寻常威胁(如地震、海啸、洪灾、重大疾病等)所致的精神、心理创伤导致个体延迟出现并长期持续性存在的精神障碍。其核心症状为警觉性增高(恐惧、焦虑)、闯入性再体验(闪回、反复重现创伤性体验)、持续性回避与刺激相关场所、情感麻木、及对未来失去信心等,为一种精神及心理失衡状态。PTSD确切的发病机制至今尚未完全阐明,因此探究PTSD的发病机制非常必要。应激反应可由应激激素-皮质酮水平来反应,皮质酮又对恐惧记忆具有重要的调节作用。杏仁核是启动恐惧、焦虑的关键区域,听觉惊吓反应(Acoustic startle response,ASR)是检测恐惧反应的典型指标。杏仁核通过对惊吓反射进行调控并实现对情绪的调制。因此本研究采用了不同分贝的声音刺激来研究PTSD大鼠的恐惧行为。抑制性门控(Inhibitory gating,IG)是机体的自适应机制,证据表明应激可以改变IG的状态,因此我们采用在体大鼠的IG检测,以探讨PTSD状态下杏仁核的反应程度。Ca2+是最重要的细胞内信使之一,如果细胞内钙浓度及细胞膜钙电流稳态破坏,则影响正常的神经传导功能。L型钙离子通道(L-type Ca2+channels,LTCCs)是Ca2+内流的主要途径,它严格控制着Ca2+进入细胞的过程,在保持钙离子稳态方面发挥着重要作用。LTCCs的α1亚单位是钙离子通道的主要功能亚基,是膜电位变化的电压感受器。目前已发现α1亚单位有四个亚型,即α1S(Cav1.1)、α1C(Cav1.2)、α1D(Cav1.3)、α1F(Cav1.4)。Cav1.2和Cav1.3在中枢神经系统都有分布,参与钙稳态、激素分泌、基因表达等多种功能的调控。CACNA1C是编码Cav1.2的基因,CACNA1D是编码Cav1.3的基因。关于PTSD发病机制的众多假说之一是钙超载导致基因功能障碍。在前期研究中检测了细胞内Ca2+浓度。发现PTSD后Ca2+浓度升高,且与Ca2+结合的钙调蛋白基因的表达增高。除了钙调蛋白,细胞内Ca2+还可结合PKC和AC等多种信号转导分子,激活这些分子从而调节下游的Ras-Raf-ERK1/2-CREB及cAMP-PKA-CREB信号转导通路进而调节恐惧、焦虑等行为。研究方法:1.使用Wistar雄性大鼠236只,采用单一连续刺激(Single-prolonged stress,SPS)方法建立PTSD的动物实验模型,分为正常对照组及SPS组。2.评估大鼠的一般状态;Elisa试剂盒检测大鼠血浆皮质酮水平;采用ASR、电生理实验检测两组大鼠的听觉恐惧变化。3.采用全细胞膜片钳技术检测杏仁核神经元L型钙离子通道的钙电流密度;4.采用免疫荧光、免疫组化、Western Blot、Real Time-PCR技术检测各组CACNA1C、CACNA1D、p-PKC、Ras、Raf1、ERK1/2、p-ERK1/2、β-arrestin2、PDE4及CREB的表达情况5.采用Elisa试剂盒检测cAMP的活性。结果:***大鼠与正常大鼠相比,皮质酮水平在刺激后的第1d和7d的9:00-10:00升高,在第1d和7d的18:00-19:00降低,皮质酮出现了钝性的波动变化,显示SPS大鼠皮质酮分泌发生紊乱。SPS后,大鼠的体重净增长下降,饮水减少,显示大鼠在刺激后一般状态受到影响。2.训练时,随着分贝的增高,大鼠惊吓幅值增高,在115 dB时最高,并且持续时间也是在115 dB时达到最长,潜伏期在115 dB时所用时间最短。在SPS 7d测试时,与正常组的大鼠相比,SPS大鼠惊吓幅值在不同分贝都有增高趋势,在115 dB时增高的差异有统计学意义;潜伏期的增高差异无统计学意义;持续时间在SPS后各分贝都有增高趋势115 dB时增高有统计学意义。3.杏仁核在正常状态及SPS状态时都有IG效应,在测试声音开始后的25 ms(N25)处,SPS大鼠的IG比值高于正常大鼠,差异有统计学意义;在40 ms(P40)处,SPS大鼠的T/C值高于正常大鼠,但差异无统计学意义。4.全细胞膜膜片钳记录显示,SPS大鼠与正常大鼠相比,在10 mV处,钙电流密度下降,差异有统计学意义。***1C的免疫荧光阳性主要表达在细胞质,荧光强度增强,CACNA1D的荧光阳性主要表达在细胞核,荧光强度降低;SPS大鼠CACNA1C的mRNA表达较正常大鼠增高,差异有统计学意义。两组之间CACNA1D mRNA表达无差异。***大鼠的Ras的光密度较正常大鼠有降低趋势,Raf1和ERK1/2光密度增强,差异有统计学意义;两组大鼠磷酸化的ERK1/2 mRNA表达无差异。两组大鼠的ERK1mRN