关键词:
严重急性呼吸综合征冠状病毒2
核衣壳蛋白
间接酶联免疫吸附分析
IgM
IgG
单克隆抗体
双抗体夹心方法
摘要:
2020年1月30日,世界卫生组织宣布严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的 2019 年冠状病毒疾病(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)成为继甲型 H1N1 流感(2009)、脊髓灰质炎(2014)、西非埃博拉病毒(2014)、寨卡病毒(2016)和刚果民主共和国埃博拉病毒(2019)之后第六次国际关注的突发公共卫生事件,严重威胁全球公共卫生安全,截至2020年6月1日已造成6,057,853人感染,导致371,166人死亡。SARS-CoV-2是一种有包膜的单股正链RNA病毒,属于β冠状病毒属。目前COVID-19 的诊断主要使用基于 RT-PCR 的方法或深度测序检测病毒基因组,但是这些检测方法依赖于采样部位存在足够数量的病毒基因组,错过病毒复制的窗口期可能造成假阴性,使得受感染的患者存在传播病毒的可能。提高检出率是提高疫情防控能力的关键。开发更快、更方便、与核酸检测互补的检测方法就尤为重要。血清学检测方法是病原检测的重要工具,因此构建检测SARS-CoV-2抗体或抗原的检测方法成为重要选择。目前对SARS-CoV-2体液反应的程度和时间动力学尚不清楚,虽然IgM抗体检测已用在COVID-19的诊断中,但IgM抗体检测的应用价值,与PCR相结合是否提高检测灵敏度和准确性,仍需进一步研究。病毒抗原是病毒的特异性标记,先于抗体在感染患者体内出现,可以达到早诊断的目的,但目前缺乏对于SARS-CoV-2抗原检测方法的研究。据此,我们建立了基于间接酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)方法的抗体检测体系,该方法方法具有实验周期短、操作简单和价格便宜等优点,根据包被蛋白种类,可以检测抗体还可以检测抗原。在建立抗原检测体系上,我们采用了双抗体夹心ELISA方法,该方法已经应用在多种病毒抗原的检测中。首先利用原核表达系统表达SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)并进行纯化,利用N蛋白构建了间接ELISA检测方法,分析了来自武汉、北京等地疑似和确诊病例抗体组成和特征。共检测了从82例确诊病例和58例疑似病例中收集的208份血浆样本。结果显示IgM和IgA抗体检测的中位时间为5天(IQR3-6),而症状发生后14天(IQR 10-18)可检测到IgG,阳性率分别为85.4%,92.7%和77.9%。在确诊和疑似病例中,IgM抗体的阳性率分别为75.6%和93.1%。症状发生5.5天后,IgM ELISA的检测效率高于qPCR方法。将IgM ELISA检测与qPCR方法结合使用时,每位患者的阳性检出率显着提高(98.6%),仅使用qPCR方法阳性检出率为51.9%。基于以上实验结果可证明SARS-CoV-2的体液免疫反应可用于COVID-19的诊断,与qPCR方法结合使用后可显著提高检出率。随后研究了双抗体夹心ELISA检测SARS-CoV-2N蛋白的方法,该方法的关键点是找到抗SARS-CoV-2的特异性单克隆抗体。通过前期发现SARS-CoV-2和SARS-CoV N蛋白氨基酸相似性为90.5%,且具有高度相似的抗原性,因此我们猜测抗SARS-CoVN单克隆抗体可与SARS-CoV-2N蛋白反应。基于课题组既往研究基础,复苏基于SARS-CoV N蛋白构建的杂交瘤细胞,筛选出了两株可与SARS-CoV-2N蛋白反应的单克隆抗体A1和A2,A1与SARS-CoV-2N蛋白反应性更强。以抗SARS-CoV-2N蛋白多克隆抗体、A1和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的抗鼠IgG抗体建立了双抗体夹心ELISA方法,利用SARS-CoV-2N蛋白和SARS-CoV-2病毒培养物作为模拟抗原来确定灵敏度,在未灭活条件下SARS-CoV-2N蛋白为0.1ng/μL时仍可检出,病毒培养物的最低检出量为20PFU。用双抗体夹心ELISA检测其他冠状病毒N蛋白、病毒培养物和咽拭子发现,此方法具有较高的特异性。对收集自不同发病时间的SARS-CoV-2感染患者的咽拭子、肛拭子和唾液样本进行抗原检测,发现此方法适用于对咽拭子样本的检测。双抗体夹心ELISA方法的灵敏度仍需进一步优化以提高阳性检出率。综上所述,本研究描述了感染SARS-CoV-2后宿主体液免疫的程度及时间动力学,且在208份血浆样本中证明将IgMELISA检测与qPCR方法结合使用显著提高阳性检出率。构建了双抗体夹心ELISA检测SARS-CoV-2N蛋白的方法,具有潜在的应用价值。