关键词：
视网膜母细胞瘤
miR-140-5p
PRC1
Wnt/β-catenin信号通路
c-Met/AKT/mTOR信号通路
侵袭
增殖
血管生成
摘要：
研究背景及目的:视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是一种好发于儿童的眼部恶性肿瘤。RB严重影响儿童的健康,约占儿童失明原因的5%。许多研究已证实miRNA参与了多种肿瘤的生理和病理过程,包括增殖、死亡、分化和代谢。Mi R-140-5p在多种肿瘤中被证实是一种低表达的肿瘤抑制因子。但miR-140-5p在视网膜母细胞瘤中的潜在作用尚不清楚。胞质分裂1蛋白调节子(protein regulator of cytokinesis 1,PRC1)作用于胞质分裂期,是胞质分裂的关键蛋白分子。有研究发现Wnt/β-catenin信号通路在视网膜母细胞瘤中起重要作用,提示其在RB预后和分子治疗的价值。然而,目前关于视网膜母细胞瘤细胞中PRC1基因沉默与Wnt/β-catenin信号通路相互作用的信息尚不清楚,非常值得进一步研究。本实验拟探讨miR-140-5p在视网膜母细胞瘤中是否具有潜在作用,并证明PRC1能否通过抑制Wnt/β-catenin通路对视网膜母细胞瘤细胞增殖、侵袭和血管生成具有抑制作用。以期探索RB新的潜在生物标志物,为RB的诊断和治疗提供新的思路。方法:1、我们进行了miRNA微阵列分析以鉴定RB组织和正常视网膜中的miRNA表达谱,q RT-PCR用于检测RB组织(n=50)和正常视网膜(n=8)中miR-140-5p的表达水平,并探讨RB中miR-140-5p水平与临床病理特征之间的相关性。接着用miR-140-5p mimics或mimics NC转染Y79和Weri-Rb1细胞,并使用q RT-PCR评估细胞转染后miR-140-5p的表达情况。然后,对这两个细胞系进行CCK-8分析和流式细胞仪分析,检测miR-140-5p过表达的Y79和Weri-Rb1细胞的增殖和凋亡情况。我们进行了Target Scan和miRanda预测miR-140-5p的靶基因,并进一步确认靶基因表达受miR-140-5p调控。利用WB实验检测转染后的Y79细胞和Weri-Rb1细胞中靶基因蛋白的表达情况,使用q RT-PCR确定RB组织中靶基因的m RNA水平(n=50)。2、c-Met被鉴定为miR-140-5p的潜在靶基因。为了进一步探索靶基因c-Met在RB细胞中的作用,在Y79或Weri-Rb1细胞中抑制c-Met,随后使用CCK-8评估细胞活性及使用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。为了研究c-Met是否是miR-140-5p的功能靶标,将Y79或Weri-Rb1细胞用miR-140-5p mimics和pc DNA-c-Met一起转染。然后,我们进行CCK-8分析和流式细胞仪分析,以评估其细胞增殖,凋亡和细胞周期。为了研究miR-140-5p是否通过调节c-Met/AKT/mTOR信号通路抑制RB细胞的生长和细胞周期,用Western blot法分析转染miR-140-5p-mimics或mimics-NC的Y79细胞和Weri-Rb1细胞的p-c-Met、c-Met、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-S6和S6。3、通过免疫组化方法分别检测正常对照组视网膜组织、视网膜母细胞瘤分化组和视网膜母细胞瘤未分化组中的组织中PRC1、VEGF、p-GSK-3β的表达情况。接着通过免疫组化进一步检测PRC1在原位或浸润性视网膜母细胞瘤组织的表达情况。RT-q PCR用于检测人RB细胞系Y79(HTB-18)、Weri-Rb1(HTB-169)、SO-Rb50、HXO-RB44和人视网膜色素上皮(RPE)细胞的PRC1表达。为了确定PRC1基因沉默对相关通路的影响,我们评估了PRC1和Wnt/β-catenin通路相关基因的关系。将RB细胞进行分组:空白组、NC组、si RNA-PRC1组、Li Cl(Wnt/β-catenin信号通路的激活剂)组、si RNA-PRC1+Li Cl组。MTT法检测PRC1基因沉默对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响,使用流式细胞术研究RPC1是否影响视网膜母细胞瘤的细胞周期,然后应用Transwell实验检测视网膜母细胞瘤细胞的侵袭性,最后进行体外血管生成实验检测PRC1基因沉默对HUVECs血管生成的影响。结果:1、miR-140-5p在RB组织和细胞中下调,并与患者存活率低相关。与miRNA基因芯片数据一致,RB组织中miR-140-5p的表达水平明显低于正常视网膜。miR-140-5p的低表达水平则预示着RB患者的预后不良;miR-140-5p的过表达抑制RB细胞的生长;miR-140-5p可以通过抑制细胞增殖、诱导凋亡和细胞周期停滞而对RB细胞发挥抑制作用。2、c-Met是RB细胞中miR-140-5p的靶基因。miR-140-5p与c-Met表达呈负相关。c-M
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