关键词：
视网膜母细胞瘤
mi R-6089
肿瘤标志物
Bax
诊断
摘要：
研究背景视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,RB）是恶性度极高的眼内肿瘤,常见于3岁以下的婴幼儿,严重影响患儿的视力,甚至可危及生命。在发达国家,RB患儿的保眼率和生存率可高达90%[1],但包括我国在内的一些发展中国家,RB患儿的保眼率和生存率则相对较低[2,3],其主要原因是由于医疗条件的限制以及患儿家长对RB的认识不足,多数患儿待出现白瞳或斜视时才到医院就诊,此时肿瘤常发展至晚期,错过了最佳治疗时期,从而导致了眼球摘除甚至死亡。因此,早期诊断及治疗对提高RB患儿保眼率和生存率极其关键。但目前尚缺乏RB特异的血液生物标志物,临床上主要依靠眼底检查、B超及CT等辅助检查并结合眼科医生的经验对RB进行诊断。所以,为了提高RB的早期诊断率,改善患儿预后,降低死亡率,筛选更加简便、灵敏和特异的分子生物学标志物尤其重要。目前RB的治疗方式主要包括静脉化疗、动脉化疗、局部治疗、放射治疗、眼球摘除等方式[4]。眼球摘除术会导致患儿永久的丧失眼球及视力,放疗会导致眼眶发育畸形及第二恶性肿瘤的发生,而化疗药物的长期使用容易出现耐药或引起如骨髓抑制、肾脏损害、神经系统损害等全身性副作用,因此探索并应用一种副作用小且有效的方法也十分关键。在判断RB治疗疗效或肿瘤复发时,目前国内外没有一项客观的血液学检测指标,仍主要依靠医生的主观经验及B超、CT等辅助检查结果判断,这可能导致不准确或错误的判断,也给患儿带来一定的风险,同时也不利于临床技术的推广。因此,也急需一种能反映RB治疗敏感、耐药或复发等与预后相关的客观血液学指标。Mircro-RNA（miRNAs）是一类进化上高度保守,具有单链形式的非编码短链RNA,其调控人类基因组中约60%的基因表达[5],参与多种生理病理过程,在肿瘤的发生发展中发挥关键作用[6]。研究发现,凋亡或坏死的肿瘤细胞可将miRNA释放入血液、尿液或脑脊液等体液中,且体液中存在的循环miRNA可被检测到[7]。循环miRNA具有抗RNA酶消化的功能,在室温下长时间放置或多次冻融的情况下仍可稳定表达。循环miRNA的这一重要特征表明其具有作为肿瘤诊断或预后标志物的客观条件与潜力。研究发现包括RB在内的多种肿瘤中都观察到miRNA的表达失调,表达上调的miRNA一般在肿瘤中发挥致癌作用,而表达下调的miRNA在肿瘤中往往发挥抑癌作用。运用miRNA激动剂或抑制剂下调致癌作用的miRNA,上调抑癌作用的miRNA可能抑制肿瘤的进展,因此miRNA也具有作为肿瘤治疗靶点的潜力。如果能靶向与RB发病特异性相关的致癌或抑癌miRNA,可能为RB的治疗带来新的突破。前期我们通过基因芯片筛选技术动态观察5例RB患儿在治疗前、治疗1个疗程、治疗3个疗程血浆miRNA的变化情况,发现miR-6089下调最显著,我们推测其可能与RB的发生或预后相关。miR-6089在RB中的表达及作用功能目前无文献报道,深入研究miR-6089与RB的发生发展关系及作用机制,可能对RB诊断及治疗方面有一定的帮助。研究目的:本研究通过检测miR-6089在RB患儿治疗前后血浆中的表达,及其在RB肿瘤组织的表达,探讨miR-6089在RB中潜在的诊断价值。通过培养Y79细胞,检测miR-6089在Y79细胞中的表达并探讨miR-6089对Y79细胞生长的作用机制。研究方法:1.采用qRT-PCR检测30例RB患儿治疗前后血浆样本中miR-6089的表达及变化,通过ROC曲线分析血浆miR-6089作为RB肿瘤标志物的诊断价值;同时采用qRT-PCR检测12例RB肿瘤组织样本中miR-6089的表达。2.应用qRT-PCR检测miR-6089在RB细胞系（Y79细胞）中的表达,采用CCK-8细胞增殖实验和流式细胞术实验分别检测转染miR-6089 minics或miR-6089inhibitor后对Y79细胞增殖和凋亡的影响。***预测miR-6089潜在的下游靶基因,同时用双荧光素酶报告基因实验检测miR-6089与下游靶基因是否有结合。***-PCR及Western blot检测miR-6089对Y79细胞Bax基因m RNA和蛋白表达的影响。*** blot检测miR-6089对Y79细胞中Bcl-2、cytochrome c以及caspase3蛋白表达的影响。结果:1.相比健康对照组,miR-6089在RB患者血浆中的表达水平显著升高（P<0.0001）;治疗后,miR-6089的表达水平显著下降（P<0.0001）;ROC曲线分析显示,血浆miR-6089应用于诊断RB时,曲线下面积（AUC）为0.913,灵敏度和特异度分别为80%和70%。2.相比正常视网膜组织,miR-6089在RB肿瘤组织中的表达水平显著升高
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