关键词:
视网膜母细胞瘤
GSDME
凋亡
焦亡
药物敏感性
摘要:
目的:视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)的化学疗法是其治疗的重要部分,但是耐药性的产生使治疗容易失败,故提高化疗药物的敏感性非常重要,所以我们研究GSDME(Gasdermin E)在RB中表达的高低与化疗药物敏感性的关系。
方法:第一部分,人RB石蜡切片免疫组化观察GSDME在肿瘤组织与瘤旁正常视网膜组织的表达差异。q RT-PCR检测人视网膜母细胞瘤细胞系Y79、WERI-RB-1和人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19中GSDME m RNA,WB和IF检测Y79、WERI-RB-1和ARPE-19细胞系中GSDME蛋白。
第二部分,卡铂诱导细胞死亡后,CCK8检测Y79和WERI-RB-1的半抑制浓度(IC50),予以IC50卡铂诱导细胞死亡,观察三种细胞死亡形态,WB检测GSDME被切割后形成的GSDME-N及通路蛋白(bcl-2、bax、caspase-9、caspase-7、caspase-3),流式细胞术采用Annexin V-FITC/PI双染检测细胞早期凋亡和晚期凋亡的数量。ELISA检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的含量。
地西他滨(DNA甲基转移酶抑制剂)以不同浓度(0、0.5、1、2、4、8、16、32 nmol/L)处理Y79和WERI-RB-1细胞24 h后,CCK8检测低浓度的地西他滨对细胞的毒性作用。不同浓度地西他滨(0、0.5、1、2、4、8、16 nmol/L)处理Y79和WERI-RB-1细胞,每24 h离心换液,重新加入相同浓度的地西他滨,共3次后q RT-PCR检测GSDMEm RNA,选取促进GSDMEm RNA增加最高的地西他滨浓度处理细胞1次/天,共3天后用不同浓度卡铂干预,CCK8检测细胞IC50,观察细胞死亡形态,WB检测GSDME被切割后形成的GSDME-N及通路蛋白(caspase-9、caspase-7、caspase-3),流式细胞术检测细胞早凋和晚凋数量,ELISA检测细胞上清液中LDH。
不同转染浓度(MOI:20,40,60,80,100)的空载慢病毒(Empty lentivirus,LV-CN)和GSDME过表达慢病毒(GSDME-overexpressing lentivirus,LV-GSDME)分别转染Y79和WERI-RB-1细胞,72 h后荧光显微镜观察转染效率。用最适MOI转染Y79细胞后予以嘌呤霉素筛选出稳转细胞株。最适MOI转染细胞Y79和WERI-RB-1细胞,不同浓度卡铂干预,CCK8检测细胞IC50,观察细胞死亡形态,WB检测GSDME被切割后形成的GSDME-N及通路蛋白(caspase-9、caspase-7、caspase-3),ELISA检测细胞上清液中LDH。
特异性不可逆caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FML)以20μmol/L的浓度处理Y79、WERI-RB-1和ARPE-19细胞24 h后,加入卡铂干预48 h后WB检测caspase-3及其切割形成的激活片段cleaved-caspase-3。用20μmol/L Z-DEVD-FML浓度干预Y79、WERI-RB-1和ARPE-19细胞24 h后,不同浓度卡铂干预细胞48 h后,CCK8检测细胞IC50,观察细胞死亡形态,WB检测GSDME被切割后形成的GSDME-N及通路蛋白(caspase-9、caspase-7、caspase-3),流式细胞术检测细胞早期凋亡和晚期凋亡数量,ELISA检测细胞上清液中LDH。
第三部分建立异种移植瘤模型,Balb/c裸鼠分为4组,第一组和第二组接种Y79细胞,第三组接种稳转LV-CN的Y79细胞,第四组接种稳转LV-GSDME的Y79细胞,约2周左右时肿瘤形成,在肿瘤体积约100 mm3时,第二组注射0.5mg/kg的地西他滨,1次/天,共7天,其余组腹腔注射同等体积生理盐水,7天后,腹腔注射50 mg/kg的卡铂,3次/周,共2周,2周后分离取出肿瘤组织,测量肿瘤组织大小、重量,TUNEL检测细胞死亡数。
结果:GSDME在人视网膜母细胞瘤组织和细胞系中表达明显降低,GSDME的表达下调降低了细胞对化疗药物的敏感性,地西他滨处理及转染LV-GSDME上调Y79和WERI-RB-1中的GSDME表达后,卡铂诱导细胞死亡的IC50明显降低,低剂量的卡铂能够达到同样的抑制作用,且生成的促死亡激活蛋白未见明显差异,但细胞的死亡方式由凋亡转变为焦亡,GSDME的表达增加能够降低化疗药物的使用剂量。抑制caspase-3激活后,在GSDME高表达的细胞中卡铂诱导细胞死亡的IC50明显增加,细胞的死亡形式由焦亡转变为凋亡,增加了化疗药物的浓度,细胞对卡铂的