教学课程资源库 更多>>

关键词： 单细胞转录组学测序   良性前列腺增生   成纤维细胞   血管内皮间质转化   免疫微环境  

摘要： 研究背景及目的 良性前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)是老年男性最常见的泌尿系统疾病之一,BPH会导致中-重度下尿路症状(Lower Urinary Tract Symptoms,LUTS),甚至出现肾积水、血尿等严重并发症,给患者生活质量和健康造成极大影响,同时也带来沉重的社会和医疗负担。前列腺体积是BPH临床进展重要危险因素之一,同为老年人群,前列腺体积差异巨大,部分前列腺始终维持在30ml以下的小体积状态,部分前列腺可不断增长至80ml以上甚至数百毫升,其分子机制尚不清楚。前列腺由于解剖结构和细胞组分复杂,因此其发生发展机制研究长时间以来很难取得新的突破。近年来随着单细胞转录组测序技术的进步,使得探索前列腺详细细胞组分以及细胞间微环境变化这些复杂问题成为可能。与以往研究聚焦于为什么老年人才发生BPH不同,本研究的切入点在于为什么同是老年人,有些人前列腺增生不明显,有些人前列腺增生显著。本研究旨在:(1)利用单细胞转录组测序研究老年人大、小体积前列腺,解析其细胞组分的不同。(2)以各细胞亚群分布不同为切入点,进一步探索关键细胞群的信号通路和关键基因变化,以探究潜在的治疗靶点。 研究方法 1.通过设置入组标准手术取得大体积前列腺和小体积前列腺各三例。 2.通过酶解消化制成单细胞悬液后去除死细胞红细胞。 3.所有细胞上机检测后建立单细胞转录组数据库。 4.合并所有样本数据建立数据库,同时设置标准对数据进行质控和过滤。 5.通过Seurat包对所有细胞进行分群,依据细胞marker基因鉴定细胞类型而后提取细胞群进行亚分群。 6.通过Cellchat包进行各个细胞间通讯分析。 7.通过Monocle包进行拟时序分析。 8.通过KEGG功能富集分析进行差异通路寻找。 9.通过免疫组化及免疫荧光染色鉴定细胞。 研究结果 临床标本H&E染色研究发现大体积前列腺主要以间质增生为主,伴随血管增殖和炎性浸润。通过对线粒体比例控制和基因含量较低的细胞进行过滤后一共获得44566个细胞,其中大体积前列腺组共26492个细胞,小体积前列腺组共18074个细胞,用KLK3鉴定Luminal上皮细胞,KRT4鉴定basal细胞,CD79B鉴定B细胞,CD3鉴定T细胞,MS4A2鉴定肥大细胞,CD163鉴定巨噬细胞,VWF鉴定血管内皮细胞,DCN鉴定成纤维细胞。我们发现大小体积前列腺数量相差最大的是肌成纤维细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。 对成纤维细胞进行亚分群发现一群既表达血管内皮细胞marker基因又表达成纤维细胞marker基因的细胞。该群细胞为大体积前列腺特有,免疫荧光染色证明了该群细胞的存在。将该群细胞合并入血管内皮后分群并进行拟时序分析发现,该群细胞位于分化的末端,可由血管内皮分化而来。至此我们提出血管内皮间质化在前列腺增生的发生发展过程中发挥作用。对成纤维和肌成纤维细胞进行拟时序分析发现成纤维细胞可以往肌成纤维细胞进行转化。 大体积前列腺中比例最高的细胞为T细胞,达到33.4%。对T细胞进一步亚分群发现,大前列腺中GZMA阳性T细胞远多于小前列腺,小前列腺中FOXP3、KLRB1、ZNF683阳性的免疫抑制细胞较多。 检测血管内皮生长因子(VEGF)我们发现其主要由肥大细胞分泌,并且大体积前列腺的表达量远高于小体积前列腺。 对大体积前列腺所有细胞群进行细胞之间的通讯分析发现成纤维和肥大细胞通过释放VEGF募集血管内皮细胞,成纤维和肌成纤维细胞通过CXCL12-CXCR4通路募集T淋巴细胞和B淋巴细胞以及单核巨噬细胞。同时T细胞和NK细胞通过CCL5-ACKR1通路对血管内皮进行募集,这可能是前列腺增生组织中血管内皮较多的一重要原因。同时T细胞和NK细胞通过GZMA-PARD3通路作用于成纤维细胞。 结论 前列腺增生主要以成纤维细胞、肌成纤维细胞和血管内皮细胞增生为主,血管内皮间质转化可能是前列腺增生的重要机制。免疫活性的增强是前列腺增生炎症微环境形成的一个重要原因,对上述血管内皮间质转化具有重要作用。肥大细胞通过分泌VEGFA募集并促进血管内皮细胞增殖。科学意义 本研究首次绘制了老龄男性大、小体积前列腺单细胞转录图谱,为后续进一步研究前列腺增生提供了数据平台和实验基础。本研究发现并鉴定一群共表达成纤维细胞和血管内皮细胞marker基因的细胞群,由此发现血管内皮间质转化在前列腺增生发生发展中发挥作用,为今后治疗前列腺增生提供了潜在靶点。

关键词： 代谢综合征   尿流动力学   前列腺增生   逼尿肌   膀胱功能  

摘要： 目的:研究良性前列腺增生(begin prostatic hyperplasia,BPH)合并代谢综合征(metabolic syndrome,MS)病人的临床研究资料和尿动力学参数,并比较BPH是否合并MS和不同MS患病情况下病人的尿流动力学特性差异。方法:回顾性收集并分析2020年01月至2022年01月于南昌大学第一附属医院确诊且行尿流动力学的BPH患者的临床资料。根据相关标准本研究最终共纳入232例BPH患者,并分为BPH合并MS组(119例)和BPH未合并MS组(113例),两组患者均完成直肠指诊、经腹泌尿系彩超及相关实验室检查,进行了尿流动力学检查,并收集了年龄、身高、体重等临床资料信息及详细病史,BPH合并MS的患者则需进一步完善病史询问、空腹血糖水平监测、血压监测、治疗药物使用情况等记录。通过分类对比所有患者临床研究资料和尿动力学指标差异,分析MS及其各个组分对BPH患者相应的尿流动力学结果的影响特点,进而为临床诊治BPH提供一定理论依据。结果:1、通过数据整理分类后(以是否合并MS分组为自变量,以患者的临床资料分别为因变量)进行独立样本t检验或单因素方差分析、卡方检验后,显示BPH合并MS组与单纯性BPH组的体重(Wt:69.0±8.8 vs 63.1±10.8)、收缩压(SBP:151.1±15.2 vs 135.0±18.5)、舒张压(DP:83.8±11.1 vs 79.6±11.0)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C:1.13±0.32 vs 1.40±0.95)、空腹血糖(FBG:13.6±5.2 vs5.30±1.87)、胆固醇(TC:4.07±0.90 vs 4.44±0.81)之间的差异均有显著统计学意义(P<0.01);两组间的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C:2.44±0.77 vs 2.66±0.71)、甘油三酯(TG:1.48±1.26 vs 1.15±0.59)的差异具有统计学意义(P<0.05);两组患者之间其余指标(身高、BMI、腰围、年龄、吸烟、饮酒、血尿酸)无显著统计学差异(P>0.05)。2、通过数据整理分类后(以是否合并MS分组为自变量,以尿动力学资料分别为因变量)进行独立样本t检验或单因素方差分析、卡方检验后,显示BPH合并MS组归化逼尿肌收缩力值较无MS组(38.4±32.4 vs 51.5±34.2)明显降低,并有显著统计学意义(P<0.01);BPH合并MS组最大逼尿肌压力值较单纯性BPH组间(96.3±35.0 vs 107.9±41.4)相比明显降低,且差异存在统计学意义(P<0.05);两组间膀胱初始尿意容量、膀胱强烈尿意容量、膀胱残余尿量、最大尿流率、URA、OBI、膀胱顺应性、膀胱稳定性、Lin梗阻关系、逼尿肌收缩力等级的差别无统计学意义(P>0.05)。3、通过数据整理分类后(以MS某一组分是否异常为自变量,以尿流动力学指标为因变量)进行独立样本t检验或单因素方差分析、卡方检验后,显示血压升高的BPH患者最大尿流率、归化逼尿肌收缩力高于血压未升高者,有显著统计学意义(P<0.01);血压升高的BPH患者最大逼尿肌压力高于血压未升高者,有统计学意义(P<0.05)。血糖升高的BPH患者归化逼尿肌收缩力高于血糖未升高者,有统计学意义(P<0.05)。HDL-C降低的BPH患者归化逼尿肌收缩力低于HDL-C未降低者,有显著统计学意义(P<0.01);HDL-C降低的BPH患者最大逼尿肌压力、最大尿流率、逼尿肌收缩力、膀胱稳定性低于HDL-C未降低者,有统计学意义(P<0.05)。腰围增宽的BPH患者归化逼尿肌收缩力高于腰围未增宽者,有显著统计学意义(P<0.01);腰围增宽的BPH患者最大逼尿肌压力、最大尿流率、逼尿肌收缩力高于腰围未增宽者,有统计学意义(P<0.05)。甘油三酯升高的BPH患者最大逼尿肌压力低于甘油三酯未升高者,有统计学意义(P<0.05)。BMI增大的BPH患者归化逼尿肌收缩力高于BMI未增大者,有显著统计学意义(P<0.01);BMI增大的BPH患者最大逼尿肌压力高于BMI未增大者,有统计学意义(P<0.05)。血尿酸升高的前列腺肥大患者归化逼尿肌收缩力、最大逼尿肌压力低于血尿酸正常者,有统计学意义(P<0.05)。另外,患者对应的相关尿流动力学指标差异在其余MS各组分的相关测量数据是否异常中均没有统计学意义(P>0.05)。4、再通过以代谢综合征每个成分的诊断指标为自变量,以尿流动力学某一指标为因变量,进行多元线性回归分析以及多元logical回归分析发现,BMI对BPH患者最大逼尿肌压力、归化逼尿肌收缩力、Lin阻力关系、逼尿肌收缩力等级有显著性影响,血糖对BPH患者OBI以及收缩压对BPH患者归化逼尿肌收缩力均有显著性影响(均为P<0

关键词： 李曰庆教授   良性前列腺增生症   网络药理学   用药规律分析  

摘要： 目的 分析李曰庆教授治疗本病用药规律和学术思想,并通过网络药理学方法,全面分析教授治疗本病核心处方的作用靶点、分子机制,为后续开展进一步实验研究提供前期依据。 方法 通过东直门医院的医院门诊系统,收集并准备李曰庆教授于2018年9月1日至2019年6月31日男科特需门诊诊治的良性前列腺增生症临床病例,由两人输入相同数据,互相核对无误后建立数据库,将其导入“中医传承辅助系统(V2.5)”软件使用。对李曰庆教授使用过的药物的进行频率、气味、归经方面的统计分析;同时利用软件对药物之间的关联规则、处方分析、新方分析进行提取,得到李曰庆教授治疗良性前列腺增生症的核心处方,并从中分析得到教授临证经验。 借助中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)和中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN)平台,获取补肾消癃化闭汤中中药的活性成分和潜在靶点,通过GeneCards数据库获得男性良性前列腺增生症靶点,构建韦恩图得到药物-疾病共同靶点。利用Cytoscape 3.6.1软件建立“复方-活性成分-作用靶点网络”,通过STRING数据库对共同靶点进行蛋白质互作分析,运用Cytoscape 3.6.1建立蛋白互作网络图。最后,借助DAVID数据库对共同靶点进行GO和KEGG功能富集分析。 结果 本次研究共纳入中医处方200首,包含139味中药,使用频次在60次以上的药物共16种,其中使用频次最高的前七种药物分别是牛膝、黄柏、黄芪、知母、肉苁蓉、茯苓、乌药。药性以温、寒、平为主,以温性药物为最,寒性药物与平性药物分列第二第三;药味以甘、苦、辛为主,排序依次递减;归经以肝肾为主,归肾经药最多。 在TCMSP和BATMAN中检索补肾消癃化闭汤的化合物成分,最终得到133种潜在核心化合物,预测出化合物对应靶点1384个。在GENECARD数据库检索良性前列腺增生症相关靶点,其中得到良性前列腺增生症相关靶点共500个。通过构建补肾消癃化闭汤潜在靶点和良性前列腺增生症靶标数据集韦恩图,从中即可获得补肾消癃化闭汤和疾病共同靶点188个。通过Cytoscape的Network Analyzer功能可对构建的网络进行拓扑结构分析,用Degree表示节点重要性,Degree前五位化合物为Quercetin(槲皮素),Boldine(波尔定碱),Kaempferol(山萘酚),formononetin(刺芒柄花素),isorhamnetin(异鼠李素)。可被认为是补肾消癃化闭汤发挥药理活性重要化合物。PPI网络分析可得到补肾消癃化闭汤治疗男性良性前列腺增生症前十位潜在核心靶点,包括TP53、CTNNB1、AKT1、ESR1、EGFR、INS、ERBB2、SRC、IGF1、STAT3。GO 分析结果提示补肾消癃化闭汤治疗男性良性前列腺增生症基因生物过程(BP)显著富集在对细胞凋亡过程的调控作用,对细胞增殖的负调控作用,蛋白质磷酸化,对细胞迁移的正向调控,磷脂酰肌醇3-激酶信号传导,一氧化氮的生物合成等过程;细胞组分(CC)主要富集质体膜的外侧,磷脂酰肌醇3-激酶复合物,焦点粘连,蛋白质络合物,膜筏,细胞溶质,质膜等部位;在分子功能(MF)主要富集在蛋白酪氨酸激酶活性,跨膜受体蛋白酪氨酸激酶的活性,ATP结合,激酶活性,酶结合,蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性,Ras鸟苷-核苷酸交换因子的活性,胰岛素受体底物的结合,细胞因子活性等方面。 结论: 1.李曰庆教授治疗良性前列腺增生症的学术经验:(1)良性前列腺增生症的病机核心为年老体衰,阴阳失衡,病理改变主以肾虚血瘀为主,同时可兼有湿热气滞;(2)李曰庆教授治疗良性前列腺增生症时喜用温和甘平之药,同时注重清补结合,攻补同用,达到阴平阳秘的状态。 2.根据网络药理学对补肾消癃化闭汤的总结结果发现,其治疗良性前列腺增生症有“多成分-多靶点”的特点,能够通过调节性激素、抗炎、促进细胞凋亡等作用机制对前列腺增生起到治疗作用。

关键词： 尿流动力学   良性前列腺增生   下尿路症状  

摘要： 目的通过研究空气传导的尿流动力学（UDS）检查在伴有下尿路症状（LUTS）的前列腺增生（BPH）患者中的应用,探讨不同UDS指标在疾病评估中的意义,为伴有LUTS的BPH的诊疗提供依据。方法收集从2020年7月至2022年3月因LUTS就诊于宁夏医科大学总医院并行UDS检查的214例BPH患者的详细临床资料。所有患者均通过行泌尿系彩超或前列腺磁共振检查并检测前列腺特异性抗原（PSA）,排除前列腺癌,诊断BPH,并行UDS检查,检测储尿期[主要包括最大膀胱容量（MCC）]、排尿期[主要包括最大尿流率(Qmax)、平均尿流率(Qave)、排尿时间（Vt）、最大尿流率时膀胱逼尿肌压力(Pdet-Qmax)、最大膀胱逼尿肌压力(Pdet max)、膀胱排空百分比（Void%）、最大膀胱内压力(Pves max)、排尿量（Vv）]及排尿后期[主要包括残余尿量（PVR）]相关指标。比较导尿法和超声法测量PVR的准确性;通过相关性分析,明确不同UDS指标之间的关系;分别基于P-Q图和Linn PURR图评估不同UDS指标对膀胱出口梗阻（BOO）的指示意义;分别基于Linn PURR图和膀胱收缩指数（BCI）值评估不同UDS指标对逼尿肌收缩力的指示意义。结果1.共有214例患者被纳入统计分析,平均年龄为67.26±10.94岁,平均前列腺体积（PV）为62.16±35.62 ml。2.导尿法测量PVR的秩平均值为163.21 ml,超声法测量PVR的秩平均值为166.93 ml,P=0.735,说明两种方法测量PVR无显著性差异。3.相关性分析显示,PVR与Vv、Void%、Qmax、Qave和Pdet max呈负相关,与MCC呈正相关,其中与Void%、Qmax、Qave和MCC的相关性较强,Spearman相关系数均大于0.5;Qmax与Vv、Void%、Qave和Pabd max呈正相关,与前三者的相关性较强,Spearman相关系数均大于0.6;Pdet max与前列腺体积（PV）、Void%和Pves max呈正相关,与PVR、MCC呈负相关。4.基于P-Q值评估BOO,Void%、Pves max、PVR、Pdet max和Pdet-Qmax对BOO程度具有预测价值,曲线下面积（AUC）均>0.7,其中Pdet-Qmax的预测价值最高,AUC=0.989。5.基于Linn PURR图评估BOO,Pdet-Qmax在BOO进程上具有显著性差异（P<0.05）;Qmax在BOO程度上无显著性差异（P>0.05）,但Pdet减弱组和非Pdet减弱组的Qmax在BOO进程上均具有显著性差异（P<0.05）;其他指标均无显著性差异（P>0.05）。6.基于Linn PURR图评估逼尿肌收缩力,PVR、Qmax、Qave、Vv、Void%、Pdet-Qmax、Pves max和Pdet max在逼尿肌收缩力进程上均有显著性差异（P<0.05）,其他指标无显著性差异（P>0.05）。7.基于BCI值评估逼尿肌收缩力,Pves max、PVR、Void%、Pdet max和Pdet-Qmax对逼尿肌收缩力具有预测价值,AUC均>0.7,其中Pdet-Qmax的预测价值最高,AUC=0.935;分别对PVR和Void%进行Pdet分组的成对比较,二者均仅在VW与其他各等级之间均具有明显相关性。结论1.空气传导的UDS检查具有操作简单、不易受外界因素干扰、成功率高的特点;2.超声法测量PVR与导尿法测量PVR有相同的意义,两者之间没有明显的差异;***同时与BOO程度和膀胱逼尿肌收缩力有相关性,不能单独作为BOO的评估指标;PVR和Pdet-Qmax可作为评估下尿路功能的重要指标。4.侵入性UDS检查是目前评估膀胱逼尿肌收缩力可靠的检查手段;Qave和Void%作为非侵入性UDS检查可获得的指标对逼尿肌收缩力具有有效的预测价值,可作为没有条件行侵入性UDS检查的医疗单位初步评估膀胱逼尿肌收缩力的参考指标。

关键词： 乳腺良性肿瘤恶性肿瘤   超声造影   鉴别诊断  

摘要： 目的：分析超声造影在乳腺良恶性肿瘤鉴别诊断中的应用。方法：选取本院2021年5月至2022年4月收治的78例（78个病灶）乳腺肿瘤患者为研究对象，78例患者均开展超声造影检查，将病理学检查结果作为参照标准，分析超声造影检查在乳腺良恶性肿瘤中的诊断价值，观察乳腺良恶性肿瘤的超声造影表现。结果：78例患者有78个病灶，经超声造影检查后，发现恶性病灶38个（48.72%），良性病灶40个（51.28%）；超声造影检查乳腺恶性肿瘤的敏感度为88.89%，特异度为85.71%，准确度为87.18%。超声造影表现：乳腺恶性肿瘤大多表现为不均匀性增强，边界不清晰，形态不规则，病灶高强度增强，病灶增强范围扩大，病灶内部有充盈缺损，有穿支血管进入病灶；乳腺良性肿瘤大多表现为均匀性增强，边界清晰，形态规则，病灶低强度增强，病灶内部无充盈缺损，无穿支血管进入病灶，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：超声造影检查用于乳腺良恶性肿瘤诊断的价值较高，可为疾病诊断及后续治疗提供参考依据，临床可进一步推广应用。

关键词： METTL3   视网膜母细胞瘤细胞Y79   顺铂耐药   MDM2   BCL2  

摘要： 目的:研究METTL3基因在视网膜母细胞瘤细胞Y79及其耐顺铂细胞株Y79/DDP中表达情况,探讨METTL3在耐顺铂细胞株Y79/DDP中的作用及潜在的分子作用机制,为预防人视网膜母细胞瘤临床治疗中的顺铂抗性提供见解。方法:我们对ARPE-19(人正常视网膜色素上皮细胞)、Y79及Y79/DDP三个细胞系进行Real-Time PCR、Western Blot实验,验证METTL3为差异表达基因。将过表达或敲低METTL3基因的慢病毒载体转染到Y79中,构建过表达或敲低METTL3的稳转株,并通过Real-Time PCR、Western Blot实验检测其m RNA、蛋白表达水平。使用MTT实验检测不同浓度顺铂在Y79过表达及敲低METTL3时增殖的影响。通过Me RIP-seq及Me RIP-q PCR明确METTL3在Y79中的靶基因,进一步在体外通过Real-Time PCR、Western Blot、流式细胞学等实验检测METTL3对相关靶基因的调控作用。结果:在本研究中,我们发现METTL3在Y79、Y79/DDP中表达水平均上调;在Y79细胞中过表达METTL3促进其增殖,同时可增强其对顺铂的耐药,敲低METTL3则抑制细胞生长及其对顺铂的耐药;机制研究表明,METTL3在Y79中通过靶向MDM2促进其对顺铂的耐药,还可通过靶向铂类耐药相关基因BCL2,抑制Y79细胞凋亡,促进Y79对顺铂的耐药。结论:我们的研究结果显示METTL3在视网膜母细胞瘤化疗耐药中起重要作用,其可通过靶向铂类耐药相关基因MDM2、BCL2,调控Y79细胞对顺铂的耐药作用,METTL3可能作为视网膜母细胞瘤潜在的诊断生物标志物及治疗靶点。

摘要： SARS-CoV-2属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科（Coronavirinea）β属。病毒颗粒多呈球形，直径50～200 nm，平均直径122 nm，具有多形性特征。包膜上粗大刺突十分显著为其形态特征。刺突呈鼓锤状或花瓣状，与包膜接触的一端稍细，长12～24 nm，粗端直径约10 nm，刺突间间距显著。球形病毒颗粒由于刺突包绕而状如日冕（solar corona），故而得名冠状病毒。

关键词： 视网膜母细胞瘤   泛素结合酶2T   临床病理特征   细胞增殖   STAT3  

摘要： 研究目的:视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤,但其发病机制尚未完全阐明,临床上尚缺乏特异性识别高危视网膜母细胞瘤的分子标记。因此探寻促进视网膜母细胞瘤发生发展的关键基因并明确其分子机制,将有助于发现视网膜母细胞瘤诊断与判断高危因素的分子标记,为提高视网膜母细胞瘤患者的治疗水平提供新靶点与新思路。 研究方法: 1、检索GEO数据库中的视网膜母细胞瘤表达谱芯片对肿瘤组织与正常视网膜组织的差异基因进行聚类分析,构建蛋白-蛋白相互作用网络,利用受试者工作曲线评估临床诊断效能结合文献检索共同筛选相关枢纽基因。在TCGA数据库、HPA与GEO数据库中确定泛素结合酶2T(Ubiquitin-conjugating enzyme 2T,UBE2T)在正常组织、细胞系、肿瘤组织与视网膜母细胞瘤中的表达情况。 2、应用免疫组化技术评估UBE2T在29例视网膜母细胞瘤组织与5例正常视网膜组织中表达情况及定位,分析UBE2T表达量与视网膜母细胞瘤发病年龄、性别、眼别、IIRC临床分组、pTNM分期、细胞分化、坏死灶、钙化灶、脉络膜侵犯、视神经侵犯与眼前段侵犯这些临床组织病理学高危因素间的相关性。 3、应用western blot与RT-qPCR检测视网膜母细胞瘤细胞系与正常视网膜色素上皮细胞系中UBE2T蛋白与RNA表达情况。 4、构建敲减UBE2T的视网膜母细胞瘤Y79与Weri-Rb1细胞系并验证敲减效果后,CCK-8法评估细胞增殖能力,Annexin V-PI法与流式细胞技术评估细胞周期和凋亡水平,western blot检测Bax与Cycs表达情况。 5、构建裸鼠皮下移植瘤模型检测UBE2T敲降后肿瘤体积与重量的变化,HE染色观察组织形态学改变,免疫荧光法检测肿瘤组织Ki67与PCNA表达情况。 6、对敲减UBE2T的视网膜母细胞瘤Y79细胞系进行RNA测序并分析通路富集情况。对GEO数据库中的视网膜母细胞瘤表达谱芯片数据集(GSE29683与GSE59983)按UBE2T表达量水平分高低表达组,进行GSEA分析通路富集情况。 7、Western blot检测敲减UBE2T后Y79、Weri-Rb1细胞系与移植瘤模型中STAT3与下游靶基因表达情况。 8、通过细胞挽救实验验证STAT3在UBE2T介导的视网膜母细胞瘤增殖中的调控作用。 研究结果: 1、在视网膜母细胞瘤数据集GSE97508与GSE110811中获得二者差异表达基因交集共121个,KEGG分析显示差异基因富集于光传导通路、细胞周期与P53通路上,PPI网络筛选并与上述两个数据集中差异最大的30个基因取交集得到9个关键基因。在独立验证数据集GSE24673中确认以上9个基因的表达差异。利用ROC曲线发现UBE2T、RRM2与RHO的AUC≥80%,RT-qPCR在视网膜母细胞瘤细胞系中确认三者表达差异。经过文献检索将候选基因聚焦于UBE2T。在HPA数据库中UBE2T在正常视网膜组织、hTERT-RPE1细胞系与视锥视杆细胞中均呈现相对低表达;在TCGA数据库中UBE2T在66.7%的肿瘤中呈高表达,在GEO数据库中UBE2T在视网膜母细胞瘤中呈高表达。 2、在29例视网膜母细胞瘤组织中均存在UBE2T阳性表达,主要表达于细胞核内,其中UBE2T高表达16例,占55.1%;UBE2T低表达13例,占44.8%;而5例正常视网膜组织标本中UBE2T均为阴性表达。UBE2T高表达与临床IIRC分级的E组,pTNM分期中T2-T4b,低分化肿瘤、存在组织病理高危因素这4项参数存在显著相关性,而与眼别、年龄、性别、坏死灶、钙化灶、视神经侵犯、脉络膜侵犯、眼前段侵犯均未发现显著相关性。 3、UBE2T在视网膜母细胞瘤Y79,Weri-Rb1和HXO-Rb44细胞系中的mRNA与蛋白表达水平均高于对照组ARPE-19细胞系。 4、敲减UBE2T后可显著降低Y79与Weri-Rb1细胞系的mRNA与蛋白表达水平,UBE2T敲减组与空白载体转染组相比细胞活性在24h,48h与72h相比均明显降低,凋亡细胞比例明显升高,G0/G1期细胞比例明显升高,而S期细胞比例明显降低;同时UBE2T敲减组Bax与Cycs蛋白表达量与空白载体转染组细胞相比均明显升高。 5、在裸鼠移植瘤标本中UBE2T敲减组与空白载体转染组相比皮下肿瘤的体积显著减小,肿瘤重量上显著减轻。HE染色显示空白载体转染相较UBE2T敲减组瘤体细胞排列更为散乱、不规则,核较大,更深染。免疫荧光显示UBE2T敲减组与空白载体转染组相比瘤体组织中Ki67与PCNA的表达强度均显著降低。 6、Y79细胞系中空白载体转染组细胞与敲减UBE2T组细胞的转录组测序结果与GEO数据库UBE2T高表达与低表达组的G

关键词： 严重急性呼吸综合征冠状病毒2   非结构蛋白12   非结构蛋白13   干扰素β   游离体DNA  

摘要： 研究背景 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的 2019 年冠状病毒疾病(Coronavirus disease 2019,COVID-19)给世界带来了前所未有的健康危机。为抵抗COVID-19,我们迫切需要了解SARS-CoV-2的各个方面,并开发有效的疫苗及抗病毒药物。鉴于SARS-CoV-2 的非结构蛋白 12(non-structural protein 12,nsp12)和非结构蛋白13(non-structural protein 13,nsp13)在病毒复制及致病机制中发挥重要作用,因此,深入研究SARS-CoV-2 nsp12和nsp13的功能十分必要。以往的IFN-β启动子荧光素酶(Interferon-beta promoter driven luciferase,IFN-β-Luc)报告实验结果显示nsp12能够抑制IFN-β启动子的激活,提示SARS-CoV-2 nsp12具有调节IFN-β的功能。因此,我们对nsp12是否具有调控IFN-β产生及Ⅰ型干扰素(Type Iinterferons,IFN-I)信号通路的功能进行了系统的免疫学研究。同时,nsp13作为SARS-CoV-2的解旋酶,具有核糖核苷酸三磷酸(Nucleotidetriphosphate,NTP)酶活性,DNA/RNA解旋酶活性以及RNA 5'三磷酸酶活性。目前,关于SARS-CoV-2 nsp13功能的研究有限,本文对nsp13的生物学功能进行了进一步研究。 研究方法 通过IFN-β启动子启动的荧光素酶报告实验检测nsp12对IFN-β启动子激活的影响,然后通过western blot实验以及IFA实验评估nsp12对转录因子激活的影响,进一步通过RT-qPCR实验和ELISA实验评估nsp12对IFN-β及干扰素诱导基因(Interferon stimulated genes,ISG)产生的影响。通过 RT-qPCR,western blot,IFA等实验检测nsp13对游离体DNA表达的影响,然后通过northern blot和mRNA保护实验评估nsp13对游离体DNA转录的影响。进一步通过质谱实验筛选与nsp13相互作用的蛋白,免疫共沉淀实验(Co-IP)用来检测蛋白之间的相互作用。染色质免疫共沉淀实验(ChIP)用来评估nsp13与游离体DNA之间的相互作用。最后,在乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)复制型质粒,HBV cccDNA,以及HBV感染等体外细胞模型中评估nsp13对HBV复制的影响,在HBV cccDNA高压尾静脉小鼠模型中评估nsp13对小鼠体内HBV复制的影响。 研究结果 本研究第一部分结果表明SARS-CoV-2 nsp12可以抑制IFN-β启动子启动的荧光素酶活性。然而,进一步的实验结果却显示nsp12并不能抑制干扰素调节因子 3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)或核因子 κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)的激活,并且nsp12也不影响仙台病毒(Sendai virus,SeV)感染或其他刺激诱导的IFN-β在mRNA和蛋白水平的表达。同时,nsp12也不影响信号转导和转录激活因子 1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)的激活以及ISG的产生。进一步的研究表明,不同的实验系统(不同的蛋白质标签或质粒骨架)会干扰IFN-β启动子荧光素酶实验中荧光素酶活性信号的检测。 本研究第二部分结果表明SARS-CoV-2nsp13可以抑制游离体DNA的表达,而不干扰染色质基因的表达。并且,nsp13抑制游离体DNA的表达发生于转录水平。进一步的研究表明,nsP13的NTP酶活性和解旋酶活性有助于其抑制游离体DNA转录。nsp13抑制游离体DNA表达需要与游离体DNA和染色体结构维持蛋白 4(Structural maintenance of chromosomes 4,SMC4)相互作用。进一步的研究表明SARS-CoV-2 nsp13在体外细胞模型和HBVcircle高压尾静脉小鼠模型中可以显著抑制HBV共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,cccDNA)的转录。 研究结论 本研究中,我们证明SARS-CoV-2 nsp12不具有调控IFN-β产生及IFN-I信号通路的功能,回答了 SARS-CoV-2 nsp12是否可以调控IFN-β反应这个科学问题,并警示研究人员在使用荧光