关键词：
丹知青娥方
自身免疫
炎症反应
良性前列腺增生
ERK1/2
摘要：
目的:良性前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia,BPH）是一类老年男性最为常见的泌尿系统疾病,炎症是其发生和发展的关键因素之一。中药丹知青娥方（Danzhi qing’e decoction,DZQE）临床用于妇女围绝经期综合征,课题组前期研究已证实DZQE可以抑制雌/雄激素诱导的大鼠BPH。本论文研究DZQE对实验自身免疫性前列腺炎诱导的大鼠BPH的抑制作用,并探讨其相关的物质基础与作用机制,为炎症诱导的BPH提供候选治疗药物。
方法:将大鼠前列腺蛋白与完全弗氏佐剂混匀制成前列腺抗原注射剂,以20 mg/只/次的剂量在大鼠颈部、背部、双侧腹股沟及后脚掌皮下注射,建立大鼠实验自身免疫性前列腺炎（Experimental autoimmune prostatitis,EAP）模型,每只大鼠注射两次,间隔20天。注射完成后,给药组大鼠每天灌胃给予临床等效剂量的DZQE（2.7 g/kg）,连续给药28天;模型组、对照组大鼠给予等量生理盐水。使用VENNO超声仪观察记录大鼠前列腺体积,末次给药后处死大鼠,分离前列腺、膀胱、精囊腺及肝、脾、肾等脏器,称重并计算各脏器指数;使用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,H&E）检测前列腺组织病理变化;使用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色法检测前列腺组织增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）,CD68以及CD206表达。收集大鼠血清,使用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）与免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,Ig G）的表达水平;用逆转录荧光定量PCR法（Reverse transcription-quantity PCR,RT-q PCR）检测大鼠前列腺组织TNF-α、白细胞介素（Interleukin,IL）-1β、IL-6、IL-17、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）与转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）的m RNA水平表达。
收集EAP诱导的BPH（EAP-BPH）大鼠与雌雄激素诱导的BPH（E2/T-BPH）大鼠前列腺组织,用转录组测序方法进行基因表达检测,进一步分析得到差异基因和共同表达的基因靶点。使用Metascape数据库进行基因本体论（Gene ontology,GO）生物进程和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）信号通路富集分析。用Western blot方法检测BPH大鼠前列腺组织ERK1/2磷酸化水平。
体外培养人前列腺增生上皮细胞（BPH-1）与单核巨噬细胞（THP-1）,使用100 ng/m L佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）联合20 ng/m L IL-4诱导THP-1细胞分化为M2型巨噬细胞,并用RT-q PCR法检测IL-10与CD206 m RNA的表达。收集M2型巨噬细胞条件培养液（M2 macrophage conditioned medium,M2CM）,以30%的比例稀释培养BPH-1细胞,建立M2型巨噬细胞诱导的前列腺上皮细胞增殖模型。同时加入DZQE单体成分丹参酮IIA（Tanshinone IIA,Tan IIA）和补骨脂酚（Bakuchiol,Ba）,用CCK-8细胞计数法检测M2CM及两种单体对细胞增殖的影响;用Western blot法检测M2CM及单体对BPH-1细胞ERK1/2磷酸化的影响;用LDH法检测两种单体的细胞毒性;用流式细胞术检测两种单体对BPH-1细胞周期的影响;进一步加入ERK1/2信号抑制剂PD98059作阳性对照,或使用Tan IIA与Ba联合ERK1/2信号激活剂C6-ceramide刺激BPH-1,进一步明确Tan IIA与Ba抑制BPH-1细胞增殖的作用机制。
结果:与对照组相比,EAP模型组大鼠前列腺体积明显增大,前列腺指数（Prostate index,PI）、肝脏和脾脏脏器指数均明显升高,其中,EAP组大鼠前列腺体积在造模后第21天开始显著高于Control组;病理学研究显示EAP组大鼠前列腺上皮细胞排列紊乱,部分区域出现复层上皮,上皮细胞PCNA表达也明显增多。IHC染色结果发现EAP组大鼠前列腺间质中CD68+与CD206+
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