关键词：
超级增强子
CDK12
视网膜母细胞瘤
增殖
肿瘤干细胞
转移
摘要：
目的:
视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma,RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤,占所有儿童癌症3%,未经治疗的视网膜母细胞瘤发展迅速,可破坏眼球结构并导致失明,还可以通过视神经直接转移至大脑,或通过血液扩散到肺、骨和其他系统器官,而脑转移是RB患儿死亡的主要原因。转录失调是介导肿瘤发生发展的关键因素,而超级增强子（Super-enhancers,SEs）是由一大簇增强子组成,可招募大量转录因子、辅因子、Mediator、RNA聚合酶II（RNA polymerase II,RNA Pol II）强有力驱动癌基因转录,从而维持肿瘤增殖、存活、干性,促进肿瘤发生发展,而RB是否存在SEs及其功能尚未有文献报道。CDK12（cyclin-dependent kinase 12,CDK12）是一种转录相关激酶,是构成SEs转录复合物必不可少组成部分,其在RB中的作用尚未明确。因此,本文旨在研究靶向SEs重要调控元件CDK12能否抑制RB恶性表型,并阐明其作用分子机制。
方法:
通过染色质免疫共沉淀测序及转录组测序鉴定RB中SEs。q RT-PCR、Western blot检测CDK12在RB中高表达。CCK8试剂（Cell Counting Kit-8）、软琼脂克隆形成、动态增殖及皮下异种移植瘤实验探究CDK12降解剂BSJ-4-116及慢病毒sh RNA靶向CDK12对RB细胞增殖作用。通过Annexin V-FITC/PI双染、台盼蓝拒染实验明确CDK12降解剂BSJ-4-116及慢病毒sh RNA靶向CDK12对RB细胞凋亡作用。通过肿瘤球形成、流式细胞术检测ALDH+细胞比例探究靶向CDK12对RB细胞干性影响。体内脑转移模型检测靶向CDK12对RB脑转移的作用。
结果:
1.染色质免疫共沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing,Ch IP-Seq）鉴定RB细胞中存在SEs。
***重要调控元件CDK12在RB细胞中高表达,而CDK13表达无明显变化。CDK12降解剂BSJ-4-116及慢病毒sh RNA靶向CDK12表达抑制RB细胞增殖及克隆形成能力,诱导RB细胞凋亡,机制探究表明诱导凋亡是通过下调抗凋亡蛋白Survivin介导的。体内抑制小鼠皮下移植瘤形成,且对小鼠无明显毒副作用。
***12降解剂BSJ-4-116及慢病毒sh RNA靶向CDK12表达降低RB细胞中ALDH+细胞比例、肿瘤球球体大小及连续传代能力。小鼠脑转移模型实验表明靶向CDK12显著抑制RB细胞脑转移。
***-Seq实验结果表明低剂量BSJ-4-116处理RB细胞选择性抑制SEs相关基因转录,综合分析RNA-Seq、Ch IP-Seq鉴定出PTPRC、CD38、ICAM2、SYK等SEs相关基因。
5.机制探究表明SEs相关基因BIRC5维持RB存活的关键靶点,PTPRC显著抑制Y79细胞ALDH+细胞比例、肿瘤球形成及连续传代能力,提示PTPRC可能是SEs调控RB细胞干性的关键癌基因。
结论:
CDK12降解剂BSJ-4-116及慢病毒sh RNA靶向SE上的转录调控元件CDK12表达可诱导RB细胞凋亡、抑制RB细胞增殖、降低肿瘤干细胞自我更新能力,最终抑制RB细胞体内生长及脑转移。机制探究表明,CDK12通过促进BIRC5活跃转录,是维持RB细胞存活的关键靶基因。同时,PTPRC是CDK12维持RB肿瘤干细胞自我更新的关键靶点。
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