关键词:
WTAP
m6A
GPX4
视网膜母细胞瘤
铁死亡
摘要:
研究背景:
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是一种高度侵袭性的眼内恶性肿瘤,主要发生在5岁以下的儿童中,占儿童失明病例的5%。尽管手术技术和化疗的进步提高了RB患者的生存率,但该疾病的异质性和复杂性使得目前的治疗结果不理想,并有可能产生化疗耐药性。据报道,在缺乏及时干预的情况下,其全球生存率低于30%。而化疗耐药的现象是导致治疗失败或肿瘤复发的重要因素,因此,迫切需要对RB的疾病进展和耐药机制进行全面研究。
肿瘤细胞中RNA表观遗传学修饰参与获得性耐药的生物学过程。mRNA的m6A(n6-甲基腺苷,n6-methylladenosine)修饰通过包括甲基转移酶样3(Methyltransferase-like3,METTL3)、甲基转移酶样14(Methyltransferase-like14,METTL14)和Wilms肿瘤1相关蛋白(Wilms tumor 1-associated protein A,WTAP)在内的多组分组装进行转录后调控。WTAP与METTL3和METTL14相互作用,控制靶RNA转录物的m6A水平。WTAP在急性髓细胞性白血病、胰腺癌、肺癌、肝癌中过表达,但WTAP在RB中的表达尚未见报道,其在视网膜母细胞瘤耐药过程中的机制仍不清楚。
近年来,铁死亡作为一种新发现的铁依赖性程序性细胞死亡机制,已被证明与各种恶性肿瘤的进展密切相关。其中,GPX4是一个至关重要的调节因子,它利用还原谷胱甘肽(GSH)将脂质氢过氧化物转化为脂质醇,从而减少脂质过氧化,抑制铁死亡。GPX4表达水平升高已在癌症中观察到,并与肿瘤进展密切相关。尽管如此,铁死亡在RB耐药中的具体作用仍未得到充分探讨,需要进一步深入研究。
研究目的:
本研究的目的是明确WTAP介导的m6A修饰是否影响了RB的生物学过程,并探究其具体的分子机制,为提供治疗新靶点以及改善化疗耐药性提供充分的理论依据。具体内容如下:(1)探究WTAP在视网膜母细胞瘤组织及细胞系中的表达;(2)明确WTAP调控视网膜母细胞瘤增殖、凋亡及周期的功能;(3)阐明WTAP参与视网膜母细胞瘤铁死亡过程的功能;(4)证实WTAP通过调控GPX4的m6A修饰介导视网膜母细胞瘤铁死亡过程的机制。
研究方法:
1、利用免疫组织化学方法、WB检测WTAP在RB组织芯片中的表达;WB检测RB细胞系Y79、WERI-RB1与正常视网膜色素上皮细胞APRE-19中WTAP的表达;构建Y79卡铂耐药细胞系后,通过RNA甲基化定量分析卡铂耐药的Y79和亲本细胞的m6A水平;进而通过WB检测卡铂耐药Y79细胞中WTAP蛋白表达水平。
2、通过CCK-8增殖实验、流式细胞学检测细胞凋亡及细胞周期观察,敲低以及过表达WTAP的Y79和WERI-RB1细胞中,阐明WTAP对RB细胞系的增殖、凋亡以及周期进程的影响;通过裸鼠成瘤模型,探究过表达和沉默WTAP对瘤体形成及生长的影响;并且,通过CCK-8增殖实验,验证WTAP对Y79卡铂耐药细胞系增殖的影响。
3.在WTAP敲低和对照Y79细胞中,通过RNA-seq测序和GSEA富集分析检测显著富集的生物学过程。为了明确WTAP对RB细胞铁死亡的效应,在RB细胞中敲低、过表达WTAP以及使用铁死亡诱导剂RSL3处理后,检测细胞中脂质ROS、谷胱甘肽二硫(GSSG/GSH)比值和丙二醛(MDA)的表达水平;并且,还检测卡铂耐药Y79细胞中脂质ROS、谷胱甘肽二硫(GSSG)/GSH比值和丙二醛(MDA)的表达水平,提示WTAP参与RB细胞的铁死亡过程。
4.通过m6A表观转录组修饰微阵列检测分析WTAP的下游修饰靶点;通过RIP-qPCR检测RB细胞中,WTAP结合GPX4 mRNA的富集情况;通过Me RIP-qPCR检测RB细胞中,WTAP敲低后,GPX4mRNA的m6A修饰水平;还通过q RT-PCR、WB检测敲低WTAP后GPX4 mRNA表达水平及蛋白表达水平;并且,通过mRNA衰减实验检测,揭示WTAP参与调控GPX4 mRNA的稳定性。
5.通过RIP-qPCR方法检测m6A结合蛋白IGF2BP3与GPX4之间的结合作用;通过q RT-PCR、WB方法检测敲低IGF2BP3后GPX4mRNA及蛋白表达水平;通过mRNA衰减实验检测,揭示WTAP-IGF2BP3轴共同参与调控GPX4 mRNA的稳定性。
6.通过WB检测Y79卡铂耐药细胞中GPX4的蛋白表达水平;并且在沉默GPX4及用铁死亡诱导剂RSL3处理后的细胞中,检测细胞中脂质ROS、谷胱甘肽二硫(GSSG)/GSH比值和丙二醛(MDA)的表达水平;通过CCK-8实验检测敲低GPX4细胞的增殖速率;通过RB组织芯片以及免疫组化检测GPX4的表达,提示