关键词：
视网膜母细胞瘤
长链非编码RNA
生物信息学
ceRNA
NEAT1
摘要：
研究背景:
视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)的发病率因国家经济差异而有所不同,平均为1/18000。RB的治疗主要以挽救患者生命为首要目标,其次是保留眼球和维持视力,治疗方法包括全身静脉化疗、选择性眼动脉化疗等。尽管RB是早期被认识的癌症之一,但仍缺乏适用于该疾病的分子靶向治疗手段,因此亟需寻找新的RB诊断标志物和治疗靶点。
长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNAs)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA,曾被称为“垃圾RNA”。随着测序技术的进展,lnc RNAs的研究变得越来越深入,发现它们参与多种生理过程和肿瘤的发生发展。Micro RNA(miRNA)是长度约为19-25个核苷酸的nc RNA,其中一种常见的调控机制是作为竞争性内源RNA(competing endogenouse RNA,ce RNA)参与调控细胞的增殖、迁移和侵袭。
核旁丛组装转录本1(Nuclear Paraspeckle Assembly Transcript 1,NEAT1)是一种lnc RNA,NEAT1在肿瘤中可以作为肿瘤抑制因子,参与DNA甲基化、组蛋白修饰等过程,影响基因的表达。其异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关。miR-506-3p的长度约为22个核苷酸,属于miRNA。通过与靶m RNA的3'非翻译区结合实现对特定基因的转录后调控。其功能多样,参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学过程。信号转导及转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)作为一种关键的信号转导蛋白,通过细胞膜受体的激活,调控下游靶基因的转录,促进细胞的增殖和生存。在肿瘤细胞中过度激活的STAT3与肿瘤的发生发展、转移和侵袭、免疫逃逸等过程密切相关。
目的:
探究NEAT1作为ce RNA竞争性结合miR-506-3p靶向作用STAT3调控视网膜母细胞瘤生物学行为的分子机制。
方法:
1、通过GEO数据库获取RB与RPE组织相关数据,通过差异分析、GO、KEGG富集分析,为RB发病机制研究提供一些潜在的基因位点。
2、通过RT-q PCR、Western blot检测RB细胞系Y-79与人正常视网膜色素上皮细胞系ARPE-19中NEAT1、miR-506-3p以及STAT3表达量,验证GEO数据准确性。
3、分别构建NEAT1过表达稳转细胞系与miR-506-3p沉默稳转细胞系,通过RT-q PCR、Western blot探究基因表型变化,通过CCK8、Transwell检测转染后RB细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。
4、分别构建NEAT1沉默稳转细胞系与miR-506-3p过表达稳转细胞系,通过RT-q PCR、Western blot探究基因表型变化,通过CCK8、Transwell检测转染后RB细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。
5、通过双荧光素酶基因报告实验验证NEAT1-miR-506-3p,miR-506-3pSTAT3是否可以相互结合,进行互作验证。并通过挽救实验,确定NEAT1通过竞争性结合miR-506-3p,进而促进STAT3过表达,促进RB生物学行为。
结果:
通过生物信息学分析,我们发现在RB和RPE中,NEAT1、miR-506-3p和STAT3在RB中的表达水平存在显著差异,随后我们通过RT-q PCR和Western blot实验证实了生物信息学分析的预测。随后我们通过构建过表达及沉默细胞系,从正反两方面论证了NEAT1、miR-506-3p和STAT3之间存在相互调控的关系。最后,我们通过双荧光素酶基因报告实验和挽救实验证实了NEAT1作为ce RNA竞争性结合miR-506-3p靶向作用STAT3调控RB生物学行为的机制。这使我们可以更全面、更深入地理解NEAT1、miR-506-3p和STAT3如何调控RB,解释了这些分子之间的相互作用对RB的影响,并为未来进一步的治疗策略提供了有力的理论基础。
结论:
1、通过生物信息学分析发现与RPE组织相比,RB组织中的NEAT1与STAT3显著升高,miR-506-3p可以与NEAT1结合,并参与调控STAT3。
2、实验结果表明,在Y79和ARPE-19细胞系中,NEAT1、miR-506-3p和STAT3在RB中的表达水平存在显著差异。
3、过表达NEAT1,可以促进RB细胞中的STAT3的表达水平,并抑制miR-506-3p的表达。同时,当沉默miR-506-3p时,可以促进RB细胞NEAT1和STAT3的表达。
4、沉默NEAT1,可以抑制RB细胞中的STAT3的表达水平,并促进miR-506-3p的表达
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