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关键词： 小鼠胚胎干细胞   拟胚体形成   细胞命运决定   Tbx20  

摘要： 目的:转录调控对于哺乳动物早期胚胎发育过程中的细胞命运决定至关重要。受精卵经过一系列复杂且连续的细胞状态转变,至胚胎着床后形成多种细胞谱系和类型。核心转录网络如何调控分化过程中的细胞命运决定,是发育生物学领域的基本问题之一。转录因子被认为是决定细胞命运、形态、和生理功能的中心指挥者[1],其作为基因表达调控网络的先驱因素,能够通过信号转导途径的层级传递来响应环境信号的改变。转录因子与细胞信号、表观遗传修饰、染色质构象等相互作用确立了细胞类型特异性的基因表达网络,是特定细胞功能建立和维持的基础。利用胚胎干细胞的自我更新、多分化潜能和自主装特性,目前已建立了较多体外模型,可以用来研究小鼠胚胎早期发育过程中的细胞分化和谱系形成事件[2]。其中,拟胚体作为经典的体外模型之一,可以模拟早期胚胎三胚层细胞的建立过程。本选题旨在利用小鼠胚胎干细胞诱导形成拟胚体的模型体系,结合单细胞转录组数据的深度挖掘,筛选鉴定出对细胞谱系分化具有重要调控作用的转录因子。 材料和方法:获得小鼠胚胎干细胞在体外分化形成拟胚体过程中不同时间点的单细胞转录组数据,通过生物信息学分析方法筛选出分化过程中与细胞谱系特异高表达的转录因子。进一步地,通过文献调研缩小候选转录因子的范围。随后利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建候选转录因子敲除的小鼠胚胎干细胞系,以进行后续的功能鉴定。首先,检查确定转录因子的敲除对于小鼠胚胎干细胞的自我更新和多能性维持能力是否有影响。随后,利用转录因子敲除的小鼠胚胎干细胞进行拟胚体形成实验,在分化的不同时间点观察拟胚体形态,与野生型胚胎干细胞的分化进行比较。采集拟胚体提取RNA后进行q RT-PCR,检测细胞谱系特异基因的表达变化情况,确定候选转录因子敲除对于小鼠胚胎干细胞分化过程的影响。 结果:我们获得小鼠胚胎干细胞分化第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天的拟胚体单细胞转录组数据。质控后,高质量细胞占比83.4%,平均每个细胞测到6000个基因。随后将细胞分群注释为:m ESC、Pre-Epi、Post-Epi、PS、EN、MES、EN、S-Ect、BP总共9个类型,我们发现内、中、外三胚层细胞谱系在分化的第10天全部出现。将各个细胞类型差异表达基因与SCENIC鉴定的转录因子寻找重叠部分,得到细胞类型特异的转录因子451个,再根据表达模式进行筛选后得到85个细胞类型特异高表达的候选转录因子。结合胚胎干细胞分化实验对内、中、外三个胚层的候选转录因子进行进一步筛选,分别鉴定出可能对内、中、外胚层形成有重要作用的转录因子各2个。其中,选择在中胚层细胞中特异性高表达的Tbx20进行功能鉴定。我们发现在胚胎干细胞中敲除Tbx20后,仍然能够长期传代,并保持>90%的细胞活率,q PCR和免疫荧光实验发现多能基因Sox2、Oct4正常表达。进一步分化实验发现,Tbx20-/-的小鼠胚胎干细胞能顺利分化形成拟胚体,相比于对照组,拟胚体形态没有显著差异,形成的拟胚体可以长时间培养至15天以上。对分化后第10天、第15天提取的拟胚体bulk-RNA进行q PCR检测,结果显示PS marker T基因和内胚层特异转录因子Dab2在第15天的拟胚体中表达下降,中胚层标记基因Hind1和Nrp1表达没有明显变化。而外胚层特异Tlx1和Nkx2-3的表达在分化过程中明显升高。 结论:1.我们从小鼠拟胚体的单细胞转录组数据中筛选出内、中、外细胞谱系特异高表达的转录因子各2个。2.利用双sg RNA CRISPR系统,构建了Tbx20缺失的小鼠胚胎干细胞株。确定Tbx20敲除对于胚胎干细胞的存活、增殖和多能性都没有影响。***20缺失的小鼠胚胎干细胞仍能正常分化出形态正常的拟胚体。中胚层特异基因仍然表达,指示Tbx20可能对于中胚层细胞的建立不是必须的。4.外胚层的标记基因表达在Tbx20缺失的拟胚体中出现了上升。Tbx20对胚层建立和谱系分化的影响需要更多的功能验证。5.通过胚胎干细胞分化形成拟胚体的模型,结合单细胞转录组测序和生物信息学分析方法,可以快速鉴定基因在胚胎干细胞向三胚层细胞谱系分化过程中是否具有重要功能,并方便地进行机制研究。

关键词： 牛病毒性腹泻   真核表达   CHO悬浮培养   攻毒与保护  

摘要： 牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）由是牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,此病的发病症状主要以发热、腹泻、繁殖障碍、免疫机能障碍等为主要特征。国际上将BVDV分为三种基因型:分别是BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3,而在我国主要发病是BVDV-1型。BVDV为黄病毒科瘟病毒属成员,基因组长约12.5 kb,是单股正链RNA病毒,有囊膜。此病发病率高,死亡率低,每年造成巨大的经济损失,是全球最重要的牛传染病之一。BVDV有4种结构蛋白和8种非结构蛋白。其中结构蛋白Erns（E0）保守性高并且具有中和表位;结构蛋白E2是决定BVDV抗原的主要部位,保守性高,具有中和活性。因此E0和E2结构蛋白可以说是BVDV的主要免疫抗原,国内外大多数的研究也是从这两个蛋白开展,本研究也主要围绕这两个结构蛋白展开研究开发新型BVD亚单位疫苗。目前用于防控BVD的传统弱毒疫苗免疫动物后无法进行鉴别诊断,存在毒力返强的可能性,具有一定的缺陷,因此针对我国的流行毒株研究出一种安全、有效的疫苗对我国的BVD防控具有重要的意义。本文为研制BVDV有效的基因工程亚单位疫苗,为BVD有效防控和鉴别感染奠定基础,利用CHO悬浮细胞表达结构蛋白,分别设计了E0序列、E2序列、E2和E0蛋白的融合序列,表达的目的蛋白都以上清可溶形式分泌表达,纯化后纯度可达95%以上,通过SDS-PAGE、Western blotting等方法分析鉴定表达产物,将重组蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后配苗,免疫新西兰大白兔后显示良好的免疫原性,通过动物攻毒实验结果表明免疫组都能保护机体发生病变。主要研究内容如下:1、通过Gen Bank中查询BVDV-1基因型的E0和E2基因序列,利用Signal P4.1 Server和TMHMM Server v.2.0软件对E0和E2蛋白信号肽及跨膜区进行分析预测,最终选取BVDV-1标准毒株NADL株基因序列为基础,确定了BVDV-E0、BVDV-E2、BVDV-E2-E0蛋白的表达策略,成功构建BVDV E0蛋白、E2蛋白、E2-E0蛋白重组真核表达质粒pc DNA3.1-BVDV-E0、pc DNA3.1-BVDV-E2、pc DNA3.1-BVDV-E2-E0。2、将构建的真核重组质粒pc DNA3.1-BVDV-E0、pc DNA3.1-BVDV-E2、pc DNA3.1-BVDV-E2-E0分别转染CHO悬浮细胞,进行上清分泌表达,在CHO悬浮细胞瞬时转染过程中依次对转染复合物的配制、DNA用量和转染时细胞密度等三个关键参数按照顺序优化,离心获取第12天的细胞上清,经SDS-PAGE鉴定结果显示BVDV重组蛋白都在上清中成功表达。3、通过收取CHO悬浮细胞培养的上清,经镍柱亲和层析纯化,样品经SDS-PAGE、Western blotting鉴定,蛋白纯度都高达95%以上,并且结果显示重组蛋白与BVDV的阳性血清和His-Tag标签抗体都能发生特异性反应。经BCA蛋白定量试剂盒检测纯化后的重组蛋白浓度,其中E0蛋白浓度为0.886 mg/m L,E2蛋白浓度为1.228 mg/m L,E2-E0蛋白浓度为1.303 mg/m L。4、本研究以新西兰大白兔为研究对象,研究BVDV-NADL标准毒对其致病性,感染后新西兰大白兔出现了体温升高和体重下降的临床症状,在感染后的前5天都可以检测到鼻腔和肛门排毒情况,外周血白细胞和淋巴细胞数都出现了先升高后降低的趋势,并且在感染后的前5天在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管等脏器中都能检测到病毒,证明BVDV-NADL标准毒在新西兰大白兔上的致病性试验成立。5、本研究动物免疫试验证明,将三种重组蛋白配伍弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,分别二次免疫新西兰大白兔,一免后第7天血清抗体呈阳性,并持续至免疫后第28天,E0蛋白免疫组血清抗体效价水平可达1:128 000,E2蛋白免疫组血清抗体效价水平可达到1:1 024 000,E2-E0蛋白免疫组血清抗体效价水平达到1:512 000,而且三组免疫后的血清抗体均可以与MDBK细胞中感染的BVDV病毒发生特异性免疫反应,进一步证实纯化的三种蛋白具有良好的免疫原性和特异性。病毒中和实验结果显示,重组E0蛋白免疫兔诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为Log10（405）=2.54,重组E2蛋白免疫兔诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为Log10（413）=2.59,重组E2-E0蛋白免疫兔诱导动物机体产生病毒中和抗体,中和效价为Log10（447）=2.80。6、本研究动物免疫攻毒保护试验发现,通过对新西兰大白兔各个免疫组鼻腔

关键词： L-5-甲基四氢叶酸   启动子   RBS序列   大肠杆菌Nissle 1917  

摘要： 叶酸(Folic acid)属于B族维生素,其代谢产物在DNA合成及甲基化、一碳单位代谢和蛋白质代谢等方面发挥重要作用,其中,L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是叶酸经过多步酶促反应后生成的唯一可以穿过血脑屏障而发挥作用的物质,已被广泛用于各种疾病的预防和治疗,具有广阔的市场前景。目前,对L-5-MTHF生物合成法的研究主要集中在以乳酸菌和枯草芽孢杆菌为底盘细胞的代谢工程设计上,而以大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘细胞生产L-5-MTHF的研究较少。本实验室前期通过引入Clostridium autoethanogenum DSM 10061的Wood-Ljungdahl途径(WLP途径)中三个酶编码的基因,甲酸-四氢叶酸连接酶(fhs)、甲酰四氢叶酸环水解酶(fchA)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(folD)并过表达大肠杆菌自身的二氢叶酸还原酶(folA)和亚甲基四氢叶酸还原酶(metF),成功地在*** BL21(DE3)中构建了一条新的L-5-MTHF合成途径,使其产量大幅提高。在此基础上,本论文通过替换关键酶、筛选启动子和优化RBS序列,调控外源基因的表达,以进一步提高L-5-MTHF的产量。同时,考虑到利用微生物生产L-5-MTHF包括发酵和纯化提取等多个步骤,制备过程繁琐,成本较高,故本论文也尝试将底盘细胞更换为能定植于肠道的益生菌*** Nissle 1917(EcN),以期实现不纯化目标产物而直接应用该工程化益生菌的目标。主要的研究成果如下:一、通过序列比对及酶活测定筛选关键酶并用于工程菌改造,替换亚甲基四氢叶酸脱氢酶(FolD)的工程菌BL21-D中L-5-MTHF产量高于出发菌株,说明提高FolD活性能够在一定程度上解除目标产物合成的限速步骤。利用质粒pET28b(+)在***21(DE3)中对来自Blautiaproducta的亚甲基四氢叶酸还原酶(BpMTHFR)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(BpFolD)进行异源表达和纯化,检测到BpMTHFR和BpFolD的特异性酶活(分别为37.791±3.95 U·mg-1和378.65±7.01 U·mg-1),说明这两个酶具有良好活性并可应用于工程菌的改造。以实验室前期构建的产L-5-MTHF的工程菌*** BL21-WL为出发菌株,用上述两个酶的编码基因替换出发菌株相应酶的基因,构建了三株工程菌,诱导发酵后采用高效液相色谱法检测L-5-MTHF的产量,替换还原酶的工程菌B L21-R产量为315.94 μg·L-1,替换脱氢酶的工程菌BL21-D产量为483.53 μg·L-1,两酶均替换的工程菌产量为363.26μg·L-1,其中BL21-D与出发菌株相比产量提高了 37.34%,选用高活性的FolD更有利于目标产物L-5-MTHF的合成。二、对工程菌*** BL21-WL中外源基因的表达进行了启动子筛选与RBS序列优化,对比出发菌株,工程菌BL21-RBS6产量提高了 60.85%,实现了 L-5-MTHF合成途径相关基因的精细化调控。以pETDuet-1质粒为骨架,选取lac和trc启动子替换质粒上原有的T7启动子起始基因fhs、fchA和folD转录,将构建的工程菌诱导发酵,测定L-5-MTHF的产量,发现与出发菌株相比工程菌BL21-99A的产量提高了 37.57%,确定trc启动子更适于目标基因的表达。进一步从MIT Registry of Biological Standard Parts数据库中选取三个不同强度的RBS序列,通过融合PCR技术将不同的RBS序列分别与基因fhs、fchA和folD相连,获得6株不同基因表达强度的工程菌,诱导发酵后通过分析工程菌粗酶液中蛋白表达情况判断外源基因的翻译水平,结合L-5-MTHF的产量选取最优RBS序列组合方式,发现利用强、弱、中RBS序列分别调控基因fhs、fchA和folD是比较理想的组合方式。三、通过基因组改造和质粒表达的方法,将L-5-MTHF合成途径引入益生菌EcN中,得到可合成L-5-MTHF的益生菌EcN-99A。以益生菌EcN为底盘细胞,将原本在pACYCDuet-1上过表达的基因metF和folA整合到基因组上进行表达,使用Red同源重组的方法将两基因的启动子替换为组成型强启动子Ptip以降低多质粒过表达给细胞带来的生长压力,同时将前期设计并优化的L-5-MTHF合成线路转入EcN中,诱导发酵后检测L-5-MTHF的产量,最终得到产L-5-MTHF的益生菌EcN,产量达到316.27μg·L-1。综上所述,本论文从关键酶、启动子和RBS序列等方面优化外源基因fhs、fchA和folD的表达,以筛选出最优的组合方式,创新性地将L-5-MT

关键词： 胚胎干细胞   Dppa3   2CLCs   Zscan4   MERVL   染色质修饰状态   甲基化水平   细胞损伤  

摘要： 囊胚内细胞团中分离得到的胚胎干细胞(ESCs)能够无限增殖。ES细胞具有的自我更新和向多种细胞系分化的潜力,在治疗退行性疾病等方面具有很大的前景。小鼠胚胎干细胞(m ESCs)包含一种罕见的“二细胞胚胎样细胞”(2C-like cells,2CLCs)群体,这类细胞群显示出与二细胞胚胎相似的特征,因此为研究合子基因组激活(ZGA)进展提供了理想的体外模型。然而,2CLCs转化和ZGA的正调节因子目前尚未完全阐明。 母源遗传因子在早期发育合子基因组激活中起着重要作用。发育多能性相关蛋白3(Dppa3)又被称作Stella,最初被认为是一种母系遗传因子。缺乏母源Dppa3的受精卵无法主动发育到早期胚胎的囊胚期,这表明Dppa3在植入前发育的卵裂阶段发挥着重要作用。父源Dppa3等位基因在二细胞胚胎阶段的基因激活并不能挽救母源缺失导致的异常,这表明Dppa3的关键功能发生在受精后且在二细胞期之前。研究发现Dppa3也在na?ve胚胎干细胞中表达,但在多能性退出时表达下调。虽然Dppa3在DNA甲基化中的一些功能已被发现,但Dppa3在2C-like状态中的作用与在ZGA上的功能和机制尚不清楚。Dux和Dppa2/4是增强ZGA的关键因子,近年来相继被报道为体内ZGA激活的非必需因子,这表明还有其他关键调控因子尚未被揭示。由于Dppa3最初被认为是卵母细胞表达因子,并且由于母源细胞因子对ZGA非常重要,因此我们研究了Dppa3是否在2CLCs转化和ZGA调控过程中发挥作用。 本课题中我们使用2CLCs系统确定了Dppa3是作为2C-like基因激活以促进2CLCs转换的新调节因子。我们以构建的Dppa3基因过表达(overexpression,OE)与敲降(knock-down,KD)的细胞系和2CLCs荧光报告细胞系为工具,通过体外实验发现了Dppa3调节ESCs中的2CLCs群体比例,通过转录测序、甲基化测序和染色质免疫沉淀测序分析检测了2CLCs相关基因的转录物水平以及DNA甲基化水平、染色质修饰状态等表观遗传因素。Dppa3 OE ESCs的DNA甲基化和染色质修饰状态分析表明,Dppa3促进了染色质构型向2CLCs的逆转。差异甲基化区域(DMR)分析确定Dppa3 OE ESCs中6920个(98.2%)低甲基化区域,而只有129个(1.8%)高甲基化区域,这证明Dppa3促进2CLCs全能性状态转换。Dppa3的过表达使ESCs转化为2CLCs也与细胞损伤反应相关,沉默Dppa3后明显阻碍了ESCs向2C-like状态的转变。 综上所述,我们的发现首次阐明了Dppa3在介导2CLCs转化中的作用,联合测序分析进一步验证了Dppa3建立的低甲基化、激活性组蛋白修饰与开放的染色质状态等表观遗传调控机制以实现正确的基因调控方面的作用,表明Dppa3是ZGA进展调控的新调节因子。

关键词： 肺癌   肿瘤相关抗原   自身抗体   基因工程   PD-1/PD-L1抑制剂  

摘要： 目的:探讨诊断精确度高的,更加适用于中国肺癌人群诊断和伴随诊断的自身抗体指标。探索这些血清自身抗体的表达与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效的相关性,旨在探索出以液体活检为基础、以自身抗体为靶标的PD-1/PD-L1抑制剂疗效预测标志物,针对当前缺乏有效PD-1/PD-L1疗效预测、监测标志物的现状,为发现新的标志物提供新的思路。方法:首先采用最大规模的人全蛋白质芯片(包含～20000个重组蛋白,涵盖～75%的人类蛋白质组)从33例不同类型的肺癌患者,8例健康人,22例非肺癌的其他肺部疾病患者血浆中筛选出能与Ig G/Ig M特异性结合且符合筛选条件的肿瘤相关抗原。然后采用基因克隆表达方法,筛选制备出上述肿瘤相关抗原。并通过固相包被法将得到的抗原包被于微孔板的聚苯乙烯底面。采集不同类型的肺癌患者血清49例,健康人血清33例,非肺癌的其他肺部疾病患者血清17例,采用“酶联免疫吸附试验ELISA”对筛选出的自身抗体进行验证。最后收集132例晚期NSCLC患者血标本,采用“酶联免疫吸附试验ELISA”探索血清自身抗体的表达与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效的相关性。结果:通过蛋白质芯片技术,筛选获得56种能与Ig G/Ig M特异性结合的肿瘤相关抗原。再根据筛选条件和生物信息学分析最终确立2种候选肿瘤抗原XAGE3(X抗原家族蛋白3)和DNAJC12(DNAJC12热休克家族蛋白)。通过基因克隆筛选制备出XAGE3和DNAJC12的肿瘤相关抗原并将其包被在微孔板的聚苯乙烯底面。Elisa结果显示,单独检测抗-DNAJC12(敏感性0.49,特异性0.94)其AUC(95%CI)为0.732(0.632-0.831),抗-XAGE3(敏感性0.796,特异性0.88)其AUC(95%CI)为0.902(0.845-0.958),并与目前肺癌公认的自身抗体之一NY-ESO-1(敏感性0.714,特异性0.54)其AUC(95%CI)为0.601(0.487-0.715)做对比。发现联合检测抗-DNAJC12和抗-XAGE3(不含Anti-NY-ESO-1)2种自身抗体时,敏感性和特异性大大提升(敏感性0.755,特异性0.96)其AUC(95%CI)为0.923(0.873-0.972)。联合检测3种自身抗体时,抗-DNAJC12,抗-XAGE3和抗-NY-ESO-1时,敏感性和特异性最佳(敏感性0.816,特异性0.90)其AUC(95%CI)为0.924(0.876-0.973)。且肺癌中筛选到的两种自身抗体表达水平普遍比非肺癌组高,p<=0.001上述结果证明该两种肺癌外周血自身抗体可用于肺癌的诊断和伴随诊断。最后采用“酶联免疫吸附试验ELISA”探索132例晚期NSCLC患者血清自身抗体的表达与PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效的相关性。就目前完成的50例病人后期随访信息和免疫治疗前后抗-DNAJC12,抗-XAGE3自身抗体含量变化,说明血清自身抗体抗-XAGE3,抗-DNAJC12对晚期NSCLC患者PD-1抗体疗效有一定预测作用。结论:联合检测抗-DNAJC12,抗-XAGE3和抗-NY-ESO-1三种自身抗体时敏感性和特异性大大提升,可用于肺癌的诊断和伴随诊断。抗-DNAJC12和抗-XAGE3两种自身抗体对晚期NSCLC患者PD-1/PD-L1抑制剂疗效有一定预测作用。

摘要： Polymeric materials with excellent performance are the foundation for developing high-level technology and advanced manufacturing. Polymeric material genome engineering(PMGE) is becoming a vital platform for the intelligent manufacturing of polymeric materials. However, the development of PMGE is still in its infancy, and many issues remain to be addressed. In this perspective, we elaborate on the PMGE concepts, summarize the state-of-the-art research and achievements, and highlight the challenges and prospects in this field. In particular, we focus on property estimation approaches, including property proxy prediction and machine learning prediction of polymer properties. The potential engineering applications of PMGE are discussed, including the fields of advanced composites, polymeric materials for communications, and integrated circuits.

关键词： 污水生物脱氮   大肠杆菌   基因克隆表达   脱氮基因   氨同化  

摘要： 目的:高氨氮污水的脱氮处理一直以来都是公众关注的焦点问题。含氮污水过度排放会导致酸沉积、气候变化、可见性降低和水体富营养化。所以,及时有效地解决氨氮污染问题刻不容缓。微生物在预防和处理高氨氮污水排放等方面发挥了重要的作用,氨氧化和反硝化是氮污染治理中的重要环节,而目前已有研究和应用的脱氮菌株主要是从环境中分离纯化的菌株,或者以克隆某种单一微生物的脱氮基因构建的工程菌,脱氮效能仍有待进一步提高。本研究利用基因工程技术,以构建出生长速率快、易培养、更能适应污水环境并可以快速降解氨氮的脱氮菌株为最终目标。 方法:本研究首先选取了不同氨氧化菌中的amoA基因进行生物信息学分析,之后以全基因组扩增或基因合成技术制备硝化过程中的关键酶基因amoA和hao、反硝化过程中的关键酶基因nirS和氨同化过程中的关键酶基因gdh A、gln A和gua A。然后将以上目的基因与p ET28a(+)和p ETDuet1空载体进行连接,通过抗性筛选、酶切鉴定和基因测序的方式鉴定重组质粒。进一步将不同的重组质粒转入大肠杆菌中,构建基因工程菌。通过IPTG诱导,分别在基因工程菌中进行目的基因的单独表达和共表达,并利用RT-PCR和Western Blot等方法检测目的基因在基因工程菌中m RNA水平和蛋白水平的表达。最后通过使用紫外分光光度法检测氨氮以及氨转化物等的浓度变化来确定构建的不同基因工程菌对氨氮的去除能力。 结果:本研究构建了单基因表达重组质粒pET28a(+)-amoA(Ne/No/Np AV)/hao/nirS、p ET28a(+)-gdh A/gln A/gua A;双基因共表达重组质粒p ETDuet1-amoA(Ne/No/Np AV)-hao、p ETDuet1-gdh A-gln A、p ETDuet1-gln A-gua A;以及相应的amoA/hao/nirS和gdh A/gln A/gua A多基因共表达工程菌。使用IPTG诱导工程菌后,在m RNA水平检测到了amoA、hao、nirS、gdh A、gln A和gua A基因的表达;在蛋白水平检测到了nirS、gdh A、gln A和gua A基因的表达,与预期分子质量大小相符。使用IPTG诱导后的p ETDuet1-gdh A-gln A+gua A-BL21(DE3)工程菌对氨氮的降解效果最好,最高降解率可达90.09%。而诱导后的amoA、hao和nirS基因工程菌的脱氮效果较BL21(DE3)野生菌并没有明显提高,未能达到预期效果。 结论:经过对基因工程菌相关基因mRNA和蛋白表达水平以及工程菌对氨氮降解效果的检测,构建的amoA、hao和nirS基因工程菌未能达到我们预期的快速降解氨氮的目的,而gdh A、gln A和gua A基因工程菌都具有显著的降解氨氮的效果,其中共表达基因工程菌p ETDuet1-gdh A-gln A+gua A-BL21(DE3)的效果最好,并在三种不同浓度的氨氮模拟污水中均具有显著的降解氨氮的效果。

关键词： 腈水合酶   固定化细胞   海藻酸钠复合载体   F127水凝胶  

摘要： 腈水合酶是一种可将腈类化合物催化生成相应的酰胺类化合物的金属酶,具有一定的工业应用价值,本课题组前期研究发现了一种具有高区域选择性的腈水合酶,并成功将该腈水合酶转化进大肠杆菌中制备出基因工程菌。用含腈水合酶的全细胞催化反应能够维持酶的基本生存条件,但是其游离细胞在催化反应过程中,容易受外界环境的影响,易失去活性,并且细胞破碎之后影响后续的分离纯化,为了改善细胞易分解不稳定的特性,细胞固定化技术受到广泛的关注。由于海藻酸钠和F127水凝胶无毒无害且生物相容性强,凝胶中孔隙多,常被用于合成包埋载体对细胞进行固定化处理,并且制备出的固定化载体回收率高、p H稳定性和温度稳定性强等。本文选取了以海藻酸钠和F127为模板的载体对前期制备的基因工程菌进行固定化研究并探究其催化性能。 海藻酸钠虽常用于细胞固定化研究,但是由于其存在稳定性低,回收率低等缺点,所以本论文以海藻酸钠小球为模板并通过分别添加玉米芯、沸石、凹凸棒土、膨润土等具有强吸附性的载体来增加单一的海藻酸钠固定化含腈水合酶基因工程菌的催化特性。同时我们也制备出CA-F127水凝胶来增加固定化细胞的的温度稳定性、p H稳定性和重复使用性等。结果表明:(1)海藻酸钠复合载体和CA-F127水凝胶的四次重复使用性均高于游离细胞,且在第四批次使用中,仍然保有50%以上的相对酶活,尤其是海藻酸钠-玉米芯复合载体在经过八次重复使用过后,仍然剩余60%的酶活。这说明在固定化之后,固定化载体易于从底物中分离,并且提高了固定化细胞的可回收率。(2)在p H稳定性的探究中,可以得出在强碱条件下,海藻酸钠复合载体的p H稳定性高于游离细胞,尤其是在p H=11和p H=12时,海藻酸钠复合载体的相对酶活仍然可以保持在50%以上;CA-F127水凝胶在强酸环境和强碱环境中,均可以维持60%的相对酶活。说明游离细胞在经过固定化之后,p H的应用范围扩大,增加了其p H稳定性。(3)相比较于游离细胞,海藻酸钠-玉米芯复合载体在储存过程中,固定化细胞酶活下降很慢且在第十天时固定化细胞酶活高于游离细胞10%,在第20天的时候,固定化细胞仍然可以保持着55%的活性。说明海藻酸钠-玉米芯储存稳定性高于游离细胞,更有利于常规化的储存。(4)海藻酸钠-玉米芯复合载体和CA-F127水凝胶的温度稳定性也有了一定的提升,当温度从25℃升高到35℃时,固定化细胞的酶活仅下降25%,且在高温条件下,固定化细胞仍然保持着30%的酶活。在工业化生产中,容易引发反应温度升高,故固定化细胞的的温度应用范围也可以进一步提高。

关键词： 不明原因反复种植失败   冷冻胚胎移植   促性腺激素释放激素激动剂   胚胎干细胞   氧化应激  

摘要： 目的:探讨冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer,FET)过程中添加促性腺激素释放激素激动剂(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRH-a)对不明原因反复种植失败(recurrent implantation failure,RIF)患者的妊娠结局的影响以及GnRH-a对胚胎干细胞的生物效应。方法:本研究为单中心队列研究,纳入华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心于2018年4月到2022年12月期间诊断的不明原因RIF患者。倾向性得分匹配(propensity score matching,PSM)用来平衡队列的混杂因素。体外GnRH-a干预胚胎干细胞的模型被用来模拟GnRH-a可能对胚胎内细胞团产生的影响,分别评估了GnRH-a对胚胎干细胞的分化潜能、增殖能力和抗氧化应激能力的影响。结果:一共有761个FET周期符合本研究设置的纳入和排除标准。PSM后,GnRH-a组(n=27)与对照组(n=77)成功匹配。两组之间匹配的指标P值均大于0.05。GnRH-a组的着床率显著高于对照组(GnRH-a组,54.05%;对照组,28.97%;P<0.05),临床妊娠率也显示出差异(GnRH-a组,62.96%;对照组,35.06%;P<0.05)。两组的持续妊娠率没有差异。体外模型表明GnRH-a可以增强胚胎干细胞的抗氧化应激能力,但不影响的胚胎干细胞的增殖能力和分化潜能。结论:与常规使用孕激素相比,额外使用GnRH-a可以改善FET周期不明原因RIF患者的妊娠结局。此外,GnRH-a可能通过内细胞团发挥作用。第一部分:不明原因反复种植失败患者冷冻周期添加GnRH激动剂临床结局研究目的:探讨FET过程中添加GnRH-a对不明原因RIF患者的妊娠结局的影响。方法:所有入选患者分为两组,对照组和GnRH-a组。对照组仅接受孕激素作为黄体支持。GnRH-a组在使用孕激素的同时,在胚胎移植移植前第3天,胚胎移植当天,胚胎移植后第3天分别皮下注射0.1mg曲普瑞林。使用PSM平衡队列的混杂因素,包括取卵时年龄、体重指数、新鲜周期的卵泡刺激素、新鲜周期获卵数、新鲜周期冷冻囊胚数、FET周期的子宫内膜厚度、FET胚胎年龄和FET胚胎数量。结果:GnRH-a组的着床率和临床妊娠率显著高于对照组。两组的持续妊娠率没有差异。结论:与常规使用孕激素相比,额外使用GnRH-a可以改善FET周期不明原因RIF患者的妊娠结局。第二部分:GnRH激动剂对胚胎干细胞的效应研究目的:探索GnRH-a对胚胎干细胞的生物学效应。方法:体外GnRH-a干预胚胎干细胞的模型被用来模拟GnRH-a可能对胚胎内细胞团产生的影响。结果:体外模型表明GnRH-a可以增强胚胎干细胞的抗氧化应激能力,但不影响的胚胎干细胞的增殖能力和分化潜能。结论:GnRH-a可能通过内细胞团发挥作用。

关键词： DNA测序   生产动态监测   产液剖面   缝高监测   井间连通性研判  

摘要： 油田生产动态监测主要针对油水井地层压力、产量、产液剖面等而进行的监测工作,能够对后续方案开发及措施调整进行及时研判,为油田开发动态分析提供依据。油田生产动态监测包括产液剖面测试与解释、缝高监测、井间连通性分析,通常存在需要停止生产,作业步骤繁杂,耗时长,成本高,污染储层,不能长时间连续监测等问题。为了解决上述问题,海外已优先提出将DNA测序技术应用于油田生产动态监测应用中,然而国内却尚未起步。 为填补国内空白,本文充分融合油藏工程、基因工程以及大数据分析三个领域内容对基于微生物DNA测序的生产动态监测方法与应用展开研究。本文主要从三方面入手,其一是建立基于微生物DNA测序的产液剖面测试与解释方法。通过对岩屑与产液取样并测序构建基于微生物特征的地下分层方法,得到高分辨率特征的微生物地层基线,通过比较朴素贝叶斯、随机森林、Bp神经网络三种聚类方法的五个评价指标优选并改进随机森林算法,构建基于PSO-随机森林算法的产液剖面解释模型,可耗时短、精度高的描述各地层产液剖面。其次建立了一种基于微生物DNA测序的缝高监测方法,通过分析产液剖面确定有效裂缝高度、最大裂缝高度与最小裂缝高度。最后建立了一种基于微生物DNA测序的井间连通关系判定方法,通过对比注采井产液的DNA测序结果,进行主成分分析等以此评价注采井间连通程度,比对传统示踪结果验证该方法的可行性。通过上述三方面应用的研究,最终实现基于微生物DNA测序的生产动态监测。 本文通过对不同阶段产液取样并测序,获取基于时间的产液剖面、裂缝延伸高度与井间连通关系,实现低成本、无污染、操作简便、长期有效的生产动态监测的目的,并且可以将监测范围从单井迅速扩大至整个油田范围。