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关键词： 人胚胎干细胞   甲状旁腺   甲状旁腺激素   类器官   GCM2  

摘要： 目的:甲状旁腺功能减退症是一种因甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)分泌不足或缺失而导致的以低血钙浓度为特征的内分泌疾病。本文旨在探索一种体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)定向分化甲状旁腺样细胞的新方法,为先天性和继发性甲状旁腺功能减退症患者提供新的细胞治疗方案。 方法:模拟人体甲状旁腺的胚胎发育过程,研究者在既往研究的基础上提出了新的分化方案假说,即按照确定性内胚层、前肠前端内胚层、咽囊内胚层和甲状旁腺样细胞四个分化阶段,逐步将h ESCs分化为人胚胎干细胞来源的甲状旁腺样细胞(human embryonic stem cells-derived parathyroid like cells,h ESC-PT)。研究者通过实验验证该分化假说的可行性,在每一个阶段分化完成时,均采用PCR和免疫荧光实验检测分化标志物的m RNA和蛋白表达水平,并定量分析每一阶段的细胞分化率。在四个分化阶段全部完成时,对h ESCs和h ESC-PT细胞进行转录组测序分析,观察分化前后细胞转录水平的变化,h ESC-PT细胞的PTH分泌功能也通过酶联免疫吸附实验进行评估。为了进一步优化上述分化方案,提高PTH阳性细胞的分化率,研究者设计了GCM2蛋白过表达实验与类器官构建两种优化方式。GCM2是甲状旁腺胚胎发育过程中的关键基因,研究者通过慢病毒转染实验构建了稳定过表达GCM2的h ESC细胞系,并诱导其定向分化,以检测GCM2蛋白在分化中的作用。人胚胎干细胞来源的甲状旁腺类器官的构建,用于评估三维立体环境对甲状旁腺样细胞体外分化的影响。 结果:模拟人体甲状旁腺的胚胎发育过程,研究者采用上述四个阶段的分化方案,将h ESCs逐步分化为h ESC-PT细胞。第一阶段分化完成时,99.33%的细胞同时表达SOX17和FOXA2标志蛋白。第二阶段分化完成时,96.51%细胞同时表达SOX2和FOXA2标志蛋白。第三阶段分化完成时,30.89%细胞表达HOXA3蛋白,27.90%细胞表达EYA1蛋白。第四阶段分化完成时,16.96%的细胞表达PTH蛋白,且在h ESC-PT细胞中,GCM2、Ca SR和CHGA蛋白的表达也能被检测到。转录组测序结果显示,h ESC-PT细胞中甲状旁腺相关基因的表达显著上调。h ESC-PT细胞能分泌PTH,且细胞外钙离子浓度降低促进了PTH的分泌。慢病毒转染实验提示,GCM2蛋白的表达缩短了细胞分泌PTH所需要的培养时间。相比于二维平面培养,甲状旁腺类器官的构建促进了甲状旁腺样细胞的分化,提高了PTH阳性细胞的分化百分比,也提升了细胞培养上清中的PTH浓度。 结论:研究者提出了一种体外诱导人胚胎干细胞定向分化为甲状旁腺样细胞的新方法,并通过GCM2蛋白的过表达与类器官构建优化该分化方案,为先天性和继发性甲状旁腺功能减退症的干细胞替代治疗垫定了基础。

关键词： 阿维链霉菌   阿维菌素   突变生物合成   多拉菌素   基因工程改造   全生物合成  

摘要： 多拉菌素（Doramectin）是一种新型阿维菌素类药物（Avermectins）。它是通过在阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）中敲除起始单元关键合成酶基因bkd FGH,然后添加外源环己甲酸前体所产生的阿维菌素衍生物,具有杀虫活性高、副毒作用小等优势。由于国内缺乏高效的多拉菌素工业生产菌株,农业、畜牧业、宠用药等方面对多拉菌素的需求大多依赖于进口。本研究尝试构建多拉菌素的高效生产菌株,为实现多拉菌素的国产化奠定研究基础。以前期实验室构建的bkd FGH基因缺失突变菌株***Δbkd为出发菌株,通过外源添加环己羧酸钠实现了多拉菌素的产生。在多拉菌素的工业生产中如果需要大量投入环己羧酸钠会大大提高经济成本。为了让细胞能够自己合成前体物,将来自Phoslactomycin B生物合成基因簇的与环己烷辅酶A合成相关的6个基因组合成两个操纵子,分别由组成型强启动子Perm E*和Pazi A4控制。将该基因线路克隆到链霉菌整合型载体p SET152中,构建出前体物合成元件表达质粒p CHC,并将其通过接合转移导入到阿维菌素前体合成阻断突变菌株***Δbkd中。获得的重组表达菌株***Δbkd::p CHC不需要添加外源前体就可以生成多拉菌素,实现了多拉菌素的全生物合成,但产量显著低于外源添加的结果,暗示着前体物的合成途径还需要进一步的优化。将环己烷辅酶A合成基因簇的启动子更换为Perm E*与Pkas O*的组合,使得多拉菌素的产量提高了2倍。同时以阿维菌素的生物合成途径及其关键合成基因的功能信息作为指导,将阻断突变菌株***Δbkd中编码C5-氧甲基转移酶的基因ave D敲除,获得双敲除菌株***ΔbkdΔD。ave D能够把“B”组分转化为“A”组分。HR-LC-MS检测结果证实在ave D缺失突变菌株中杂质“A”组分被消除,有效“B”组分显著增加,使得多拉菌素产量增加了3倍。ave C基因对于确定产物中“1”和“2”组分的比例至关重要。将含有十个位点突变的ave Cmn基因导入到菌株***Δbkd中,构建得到ave Cmn基因的表达菌株***Δbkd::p CHC-EK-Cmn。HR-LC-MS检测发现在其发酵产物中“2”组分减少,“1”组分增加,其中多拉菌素产量增加了1.4倍。寡霉素和多拉菌素会竞争使用相同的底物池。通过敲除寡霉素合成途径中的专一性正调控因子olm RI和olm RII,构建得到三敲除菌株***ΔbkdΔDΔolm R,虽然没能显著提高多拉菌素的产量,但消除了对生物体有毒性的寡霉素,提高了产物的安全性。本研究通过分子生物学手段,实现了多拉菌素的全生物合成,随后从化合物的生物合成及代谢途径出发,利用基因工程改造逐步提高了多拉菌素的产量,为后期多拉菌素工业化生产菌株的培育和筛选奠定了基础。

关键词： 胚胎干细胞   视网膜类器官   酒精   白藜芦醇   转录组测序  

摘要： 背景 胎儿酒精综合征(FAS,fetal alcohol syndrome)是一种由产前酒精暴露引起的神经发育障碍。其全球患病率为0.77%,欧洲和北美的患病率达2～5%。在美国,每年约有54亿美元用于治疗FAS,给社会和家庭带来了沉重的负担。FAS患儿常出现眼部缺陷,包括小眼球、视神经发育不全、白内障和低视力。目前尚无特异性有效药可用于预防或治疗FAS。白藜芦醇作为一种天然多酚类化合物已被发现具有抗氧化、抗炎、心血管保护和抗衰老等多种有益作用。最近的研究证实,白藜芦醇可以减轻糖尿病大鼠的视网膜炎症和神经细胞凋亡;白藜芦醇预处理也可以防止酒精导致的小鼠出生后海马神经发生缺陷。然而,白藜芦醇是否对FAS有保护作用仍未可知。受制于伦理因素,目前缺乏人源性模型用于探索FAS的发病机制及白藜芦醇对FAS的确切作用。近年来,基于人胚胎干细胞(ESC,embryonic stem cell)或诱导多潜能干细胞(iPSC,inducedpluripotentstem cell)体外三维建立的类器官模型可以在结构和功能上模拟特定器官的发育,已经成为研究疾病发病机制、药物筛选和再生医学的强有力武器。 目的 首先通过比较不同视网膜类器官三维诱导方案的差异对诱导方案进行优化,在此基础上利用人胚胎干细胞来源的视网膜类器官建立酒精视网膜损伤模型,观察酒精对早期神经视网膜发育的影响,最后通过给予白藜芦醇预处理进一步探索其对视网膜酒精损伤的保护作用及潜在的分子机制。 方法 (1)利用细胞免疫荧光、流式细胞计数、碱性磷酸酶染色方法鉴定H9-ESCs细胞系的胚胎干性; (2)对传统视网膜类器官三维诱导方法进行改良,通过明场拍照、免疫荧光染色手段观察改良新方法与两种传统方法(经典BMP4递减法和改良EB法)诱导形成神经视网膜形态的差异; (3)诱导第30天,50mM无水乙醇覆膜处理6小时以构建视网膜酒精损伤模型。在第30天,第37天,第44天收样。利用流式细胞计数、石蜡切片免疫荧光、TUNEL凋亡染色观察单次或双次酒精对早期视网膜类器官发育的影响,包括视网膜类器官体积大小、视网膜细胞增殖凋亡及细胞迁移等情况; (4)通过在酒精处理前加入5μM白藜芦醇建立早期神经视网膜酒精损伤保护模型,利用石蜡切片免疫荧光、TUNEL凋亡染色及RT-qPCR检测白藜芦醇对酒精视网膜损伤的保护作用,主要观察类器官体积大小、视网膜细胞增殖凋亡、细胞迁移以及视网膜相关标志物的mRNA水平差异; (5)基于转录组测序手段,利用R语言分析白藜芦醇预处理组和酒精暴露组神经视网膜差异表达基因,通过GO、KEGG、GSEA富集分析预测白藜芦醇预处理保护神经视网膜免受酒精损伤的潜在分子通路; (6)通过加入预测通路的抑制剂和激动剂,利用RT-qPCR、石蜡切片免疫荧光以及蛋白免疫印迹法在基因和蛋白水平对筛选的信号通路进行下一步验证。 结果 (1)H9-ESCs细胞系在无饲养层细胞环境中呈典型克隆样生长,核大且圆,高表达胚胎干细胞标志物NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4及TRA-1-60,并且碱性磷酸酶染色呈强阳性。三种神经视网膜诱导方法在第6天均生成边缘光滑的圆形拟胚体结构,第9天开始拟胚体边缘出现类视泡样结构,直到诱导的第30天早期神经视网膜结构逐渐形成,并表达人视网膜发育早期相关标志物CHX10、Ki67、PAX6、SOX2、TUJ1及NESTIN。在视网膜类器官整体形态上,经典BMP4递减法形成的拟胚体形态差异较大,部分神经视网膜出现囊泡化及相互粘连融合的情况;而改良EB法诱导的神经视网膜虽然一定程度上减少了囊泡化现象,但是粘连融合情况更严重;相比较而言,改良新方法诱导形成的拟胚体大小更均一,神经视网膜极少出现囊泡化和粘连。改良新方法诱导成功率平均值为87.39±5.89%,明显高于经典BMP4递减法(26.9±10.28%)和改良EB法(69.24±9.15%)(P<0.001); (2)采用改良新方法成功建立酒精视网膜损伤模型及白藜芦醇视网膜酒精损伤保护模型。酒精暴露及白藜芦醇预处理对视网膜类器官体积大小无显著影响(P>0.05)。免疫荧光结果显示,在诱导第30天,酒精暴露后神经视网膜外层Ki67及CHX10双阳性增殖型视网膜祖细胞及内层PAX6阳性视网膜祖细胞数量明显减少,并且内核层TUNEL阳性凋亡细胞明显增多。这种抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用一直持续到酒精暴露后的一周(第37天)及两周(第44天)。白藜芦醇预处理,尤其是两次预处理可以明显改善酒精导致的视网膜祖细胞损伤。此外,免疫荧光结果还显示,两次酒精暴露后TUJ1 阳性神经节细胞从神经视网膜由外向内迁移的速度明显变缓,伴随着BRN3 阳性神经节细胞数量的减少,而白藜芦醇预处理能明显促进神经节

关键词： 骨转移瘤   基因工程化造血干细胞   免疫治疗   免疫检查点治疗   转化生长因子-β  

摘要： 骨是乳腺癌、前列腺癌和肺癌最常见的转移目的地之一。超过60%的骨转移并不局限于骨骼,而是会发展成全身性转移,导致患者死亡。骨转移瘤往往伴随着骨痛和骨质的破坏,严重地损害了患者的生活质量。免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade,ICB)疗法通过阻断免疫检查点分子,激活机体的免疫系统,从而达到抑制肿瘤生长的作用。尽管ICB疗法在部分肿瘤临床实验中取得了令人满意的结果,但ICB治疗对大多数骨转移患者治疗效果甚微或者无效,这在很大程度上由于骨免疫微环境带来的障碍。与其他软组织器官相比,骨转移中的转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)不仅由肿瘤细胞分泌,也由被破坏的骨基质分泌,而骨髓中高水平的TGF-β是骨转移瘤对ICB治疗响应性低的关键原因之一。在本文中,基于骨转移瘤中特殊的免疫抑制微环境,我们制备了高表达程序性死亡蛋白-1(Pogrammed cell death protein 1,PD-1)的基因工程化造血干细胞,用于骨靶向输送TGF-β小分子抑制剂SB-505124(SB),通过逆转骨转移瘤内的免疫微环境,从而提高骨转移瘤对ICB治疗的响应性,主体的研究内容包括以下部分:第一章:简要地介绍了骨转移瘤的危害以及其在细胞层面的发生机制、目前的治疗方法和相关研究进展,随后我们介绍了近几年研究的新型给药系统,并初步探讨了本研究的研究基础以及研究内容;第二章:构造骨转移瘤模型,通过对比皮下瘤和骨转移瘤的免疫微环境,发现骨转移瘤内高TGF-β水平诱导CD4+T细胞更多地向TH17(T helper 17 cells)和Treg(regulatory T cells)分化,无法诱导CD8+T激活,从而塑造了独特的骨转移瘤免疫抑制微环境;第三章:利用造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)的靶向性,以造血干细胞作为载药平台,将脂溶性的TGF-β小分子抑制剂——SB,负载在造血干细胞脂溶性的膜上,制备了 SB@HSCs给药系统并进行表征。通过尾静脉注射该制剂治疗骨转移瘤,使其能够重塑骨转移瘤内部免疫抑制微环境,提高骨转移瘤对ICB治疗响应性;第四章:我们将造血干细胞进行基因工程化使其表达PD-1,并评价其与PD-L1结合能力,骨靶向效应,在骨龛位的增殖情况以及安全性评价。更重要的是,SB@HSCs-PD-1给药系统尾静脉注射到小鼠机体能有效地抑制骨转移,减少骨损伤的,延长患肿瘤小鼠生存周期;第五章:讨论并总结了本研究面临的不足之处,并分析本研究的潜在价值,并对未来发展方向进行探讨;总而言之,本文以造血干细胞为载药平台,进行基因工程化制备了具有骨靶向能力的HSCs-PD-1@SB给药系统。此外,这项技术还可以启发造血干细胞表达其他治疗性蛋白,用于骨病治疗。由于造血干细胞药物递送平台易制备、可塑性强、生物安全性高,我们认为这项技术具有优秀的临床转化潜力。

关键词： 巨噬细胞   基因工程   细胞过继疗法   纳米前药   实体瘤  

摘要： 缺乏明确的免疫治疗靶点和非特异性全身化疗导致的严重副作用是各类实体瘤临床药物治疗所面临的严峻挑战。高毒性,低免疫原性以及易转移的肿瘤特征使得传统化疗和新兴的免疫疗法对实体瘤的临床治疗预后较差,有鉴于此,我们开发了一种以巨噬细胞为基体的智能前药靶向递送-激活系统。利用精氨酸酶1(Argnase-1)启动子调控下的酪氨酸酶(Tyrosinase)质粒对巨噬细胞进行体外基因改造,工程化改造后的巨噬细胞具备在肿瘤微环境中特异性表达外源酪氨酸酶的能力,装载了对乙酰氨基酚(APAP)前药的介孔硅纳米颗粒(MSNs)通过胞吞被负载到工程化细胞内部,跟随其一起靶向到肿瘤微环境(TME)中。在实体肿瘤的免疫抑制肿瘤微环境下,工程化巨噬细胞会逐渐向M2型极化,这一极化过程伴随着Argnase-1启动子的激活,此时外源导入的质粒开始大量表达酪氨酸酶,随着酪氨酸酶的表达被TME激活,肿瘤内外源酪氨酸酶的表达量在逐渐升高的同时将跟随工程化巨噬细胞到达肿瘤微环境中的APAP纳米前药催化为高毒性化疗药物苯醌代谢物(AOBQ),从而对实体肿瘤进行原位化疗。这一策略在体外和体内表现出对4T1三阴性乳腺癌模型优异的治疗效果和良好的生物安全性,因此智能前药靶向递送-激活系统可以作为一种潜在的三阴性乳腺癌以及类似肿瘤特性的实体瘤临床治疗替代方案。

关键词： 年龄相关性黄斑变性   人胚胎干细胞   视网膜色素上皮   补体H因子   补体抑制剂  

摘要： 目的: 年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration,AMD）是导致老年人群严重视力损害的视网膜变性疾病。AMD的发病机制尚未完全阐明,眼内局部补体的异常激活与AMD的发病相关;针对AMD所伴发的视网膜萎缩病变尚无明确的治疗手段。目前的临床试验中,人类胚胎干细胞（Human embryonic stem cells,hESC）来源的视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelium,RPE）细胞移植治疗AMD的安全性和有效性已得到初步证实。然而AMD患者眼内因补体激活和炎症而形成的异常微环境,以及免疫排斥反应,使移植细胞的长期存活和发挥正常功能面临挑战。因而如何提高移植RPE细胞在眼内的存活及功能成为眼科领域重要的研究课题。最近的临床试验表明,补体抑制治疗可以有效延缓AMD地图状萎缩（主要病理改变为RPE细胞死亡）的进展。本研究的第一个目的就是通过将hESC在体外分化成RPE细胞（hESC-RPE细胞）,为本研究提供移植的RPE细胞来源;第二个目的就是建立补体激活的体外和体内模型,用于测试补体抑制剂对RPE细胞存活的影响;第三个目的是研究玻璃体腔注射补体抑制剂是否可以提高移植于视网膜下腔的RPE细胞的存活率,及其对视网膜功能的影响。希望整个研究可以为AMD的治疗策略提供新的见解。 方法: 1.将hESC通过自发分化为hESC-RPE细胞,利用RT-qPCR、免疫荧光染色和核型分析进行鉴定; 2.采用酵母聚糖（Zymosan）激活人和小鼠血清中的补体替代途径,构建体外补体激活模型; 3.观察已进入临床试验的三种补体抑制剂（Compstatin、Danicopan和Iptacopan）在人和小鼠血清中对hESC-RPE的保护作用; 4.利用CRISPR/Cas9技术构建补体H因子（Complement factor H,Cfh）基因敲除小鼠,并通过Sanger测序验证基因编辑结果,ELISA检测小鼠血清CFH因子浓度,组织切片染色观察补体激活产物C3b在小鼠肾小球中的沉积情况; 5.采用经鼻吸烟法构建具有补体异常激活、视网膜变性、视功能异常的Cfh+/-吸烟小鼠模型,免疫荧光染色观察视网膜中补体激活产物C3b的沉积,以及视网膜变性的病理改变,利用视网膜电图（ERG）检测视功能异常; 6.将Cfh+/-吸烟模型小鼠分为四组,分别给予Iptacopan玻璃体腔注射、hESC-RPE细胞视网膜下腔移植、视网膜下腔移植hESC-RPE细胞联合玻璃体腔注射Iptacopan,以及溶剂注射对照组,4周后首先用ERG检测小鼠视功能,然后取眼球进行免疫荧光染色检测补体激活情况、小胶质细胞数量及分布、光感受器细胞形态以及移植的hESC-RPE的存活情况。 结果: ***通过自发分化获得的hESC-RPE细胞具有RPE细胞典型的形态特征,并表达了RPE细胞相关基因的m RNA和蛋白,分化过程中未发现染色体结构异常; ***可激活人和小鼠血清中的补体替代途径,并导致补体激活产物C3b、MAC（Membrane attack complex,膜攻击复合体）在hESC-RPE细胞表面沉积。临床试验中使用的C3抑制剂Compstatin可以抑制由Zymosan诱发的人血清补体激活,但对小鼠血清无效。而B因子抑制剂Iptacopan可以抑制小鼠血清补体替代途径的激活,因此可以用于本研究小鼠模型的补体抑制; ***测序验证了Cfh基因编辑结果,Cfh基因敲除模型小鼠血清中CFH含量减少,补体替代途径异常激活,C3b在肾小球中沉积;Cfh+/-小鼠经鼻吸烟处理后,视网膜-脉络膜中C3b沉积,视网膜内小胶质细胞增多,光感受器细胞变性,细胞凋亡增加,小鼠ERG异常; ***+/-吸烟模型小鼠玻璃体内注射Iptacopan后,视网膜、RPE-Bruch膜-脉络膜复合体中的C3b沉积明显减少,视网膜中活化的小胶质细胞减少,外核层凋亡细胞减少,延缓了光感受器细胞变性,ERG的a波振幅改善; ***-RPE细胞移植到Cfh+/-吸烟模型小鼠视网膜下腔后,C3b在移植的hESC-RPE细胞上沉积,小胶质细胞移行进入移植的hESC-RPE细胞集落中; ***-RPE细胞移植联合Iptacopan治疗后,hESC-RPE细胞上沉积的C3b减少,移植细胞团内浸润的小胶质细胞减少,小鼠视网膜中凋亡的细胞减少,光感受器细胞病变进程有所缓解,ERG的a波振幅部分恢复; 结论: 1.本研究通过体外和体内模型,发现补体异常激活的微环境可严重威胁hESC-RPE细胞的存活; 2.在补体异常激活条件下,补体抑制药物对于hESC-RPE细胞具有保护作用; 3.干

关键词： poly(A)尾巴   m6A   PAIso-seq2   小鼠胚胎干细胞   NIH3T3细胞  

摘要： DNA和蛋白质的修饰作用所引起的表观遗传调控已经得到了许多深入的研究,但是对于RNA的修饰作用仍是一个研究较少的领域。目前已知的RNA修饰已超过百种,这些转录后修饰对各个领域的RNA分子都有着十分重要的调控作用。然而,对于这些RNA修饰的位置和功能的了解确是十分有限。同时由于复杂的RNA结构与功能也使得研究RNA修饰的生物学作用成为一项具有挑战性的工作。在真核生物中,5'端的帽子以及3'端的多聚腺苷酸[polyadenylation,poly（A）]尾巴在转录调控中扮演着重要的角色,而在信使核糖核酸（messenger RNA,m RNA）的内部也存在的一些修饰作用可用于维持m RNA的稳定性。其中N6-腺苷酸甲基化修饰（N6-methyladenosine,m6A）是哺乳动物m RNA和长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）中最常见的转录后化学修饰。在哺乳动物和酵母中,RNA的m6A修饰优先发生在基因编码区和3'端非编码区（3'untranslated region,3'-UTR）,说明m6A修饰在转录后调控的每一个环节都起着至关重要的作用,其中包括m RNA的翻译、剪接和稳定性等。Poly（A）尾巴是绝大多数m RNAs和lnc RNAs的3'末端非模板聚合而成的一段序列。Poly（A）尾巴在m RNA的稳定性、运输和翻译过程中发挥着重要的作用。揭示poly（A）尾巴的组成、长度、调控及功能将为许多的生物学相关过程的研究带来全新的启示。随着第二代测序技术的快速发展,转录组水平已经得到了广泛的研究。但poly（A）尾巴的信息却在二代测序中是缺乏的,因此poly（A）尾巴的全长序列迟迟无法确定。为了弥补这一空缺,基于三代测序研发的包含poly（A）尾巴在内的全长转录本的测序技术[poly（A）inclusive RNA isoform sequencing,PAIso-seq]及其第二版本的PAIso-seq2测序技术被成功开发。这些技术实现了在转录组范围内测量poly（A）尾巴的长度,及其内部和3'端非A碱基以及全长c DNA。由于转录组学的迅速发展与测序技术不断的完善,不同RNA修饰的功能之间是否具有相关性成为了一个值得人们深入探究并且具有深远意义的课题。本研究结合m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）和PAIso-seq2测序技术,通过构建包含poly（A）尾巴的包含m6A修饰的全长RNA测序文库从而完成一系列生物信息学分析,对poly（A）尾巴的长度及非A碱基进行分析,最终分析m6A修饰作用与m RNA和lnc RNA的poly（A）尾巴之间的关系。论文研究发现在小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）和3T3细胞中,m6A修饰的m RNA被多聚腺苷酸化的比例更高并且具有更长的poly（A）尾巴。除此之外,poly（A）尾巴中含有非A碱基的比例也有所不同。在小鼠ES细胞,m6A修饰的m RNA中poly（A）尾巴含有非A碱基的比例显著降低。而小鼠3T3细胞中,m6A修饰的m RNA中poly（A）尾巴的非A碱基比例降低幅度却很小。因此m6A修饰的m RNA中poly（A）尾巴含有非A碱基的比例是细胞类型特异性的。除此之外,本论文还对m6A修饰的lnc RNA也进行了同样的分析。实验结果发现,m6A修饰的lnc RNA也具有更长的poly（A）尾巴,并且m6A修饰的lnc RNA中poly（A）尾巴含有非A碱基的比例也存在显著降低的现象。那么在其他物种中是否也存在这样的发现,值得人们在未来继续不断的探索。综上所述,本研究对m6A修饰m RNA和lnc RNA的poly（A）尾巴进行了动态分析,并证明了m6A修饰与m RNA和lnc RNA的poly（A）尾巴之间存在相互作用。除此之外,本论文所获得的全长c DNA信息也为m6A修饰与选择性剪接、选择性多聚腺苷酸化之间的相互作用提供了一个良好的研究方案。本论文的研究也为不同转录后RNA修饰之间的相互作用提供了一个很好的例子,对于进一步探索两种最丰富的RNA转录后修饰的功能协调提供了重要的参考价值。

关键词： 胚胎干细胞   脊索动物特异蛋白   NFE2L3   细胞增殖  

摘要： 进化过程中不断产生的新基因可以在基本生物学过程中迅速演化出不可或缺的作用,同时也对进化分支特异性结构和功能的形成至关重要,因此对于新基因功能的研究具有重要意义。以往研究表明,不同门的物种在胚胎发育中期表现出较大的差异性,门特异性基因在此过程中可能起到重要作用。胚胎干细胞(ESC)的干性维持和分化是胚胎发育中期的重要事件,因此我们重点关注了胚胎干细胞干性维持和早期分化中脊索动物门特异基因的作用。 本研究基于公共数据库中ESC向三胚层分化的转录组数据,筛选可能在ESC中起重要作用的脊索动物特异的基因,通过序列、结构、功能和进化多角度分析确定NFE2L3作为实验验证基因,并进一步通过分子细胞实验探究NFE2L3基因在ESC中的功能。 诱导人源胚胎干细胞系H9细胞向三胚层分化并通过观察细胞形态和q PCR检测ESC干性标志基因和三胚层标志基因表达量,证明H9细胞成功诱导分化成三胚层细胞,并且NFE2L3基因表达情况与已发表的组学数据趋势相符(在H9细胞中高表达,在三胚层细胞中显著下调)。通过si RNA干扰技术敲低H9细胞NFE2L3基因,并通过对2个si RNA瞬转敲低NFE2L3后24h和36h的细胞样品进行了RNA-seq检测,筛选差异基因并进行差异基因统计、GO富集、KEGG富集分析,结果显示差异基因富集到转录调控、细胞凋亡、细胞周期、多细胞发育等生物过程。 基于RNA-seq数据分析提供的新线索,对NFE2L3敲低细胞相关表型进行实验探究。通过Annexin V-FITC和PI双染色法用流式检测细胞凋亡情况,显示NFE2L3敲低24h和36h时,细胞凋亡水平升高;通过PI染色法用流式检测细胞周期情况,显示NFE2L3敲低24h和36h细胞S期减少,G2/M期增加;通过CCK8检测细胞增殖情况,显示NFE2L3敲低48h后细胞增殖能力更强。进一步构建NFE2L3稳定敲低的H9细胞系,q PCR和WB检测证明NFE2L3在m RNA水平和蛋白水平均被敲低,成功构建了稳定敲低NFE2L3的H9细胞系;通过CCK8检测细胞增殖情况,显示NFE2L3稳定敲低的H9细胞增殖能力更强。 综上,本课题通过敲低H9细胞NFE2L3后,检测不同时间点细胞表型变化,结果显示NFE2L3对H9胚胎干细胞状态的维持起到重要作用,其敲低会影响胚胎干细胞正常状态。本研究发现NFE2L3敲低后对H9细胞的影响效应不是单一的,具有时间差异性:在敲低早期,如24h和36h细胞凋亡增加,而在后续时间点,如48h后和稳定敲低的细胞中增殖能力增强。这种现象在肿瘤细胞中已有研究,并称之为“apoptosis-induceproliferation”凋亡促进增殖现象。NFE2L3长期稳定敲低的细胞增殖能力更强,表明NFE2L3在ESC中可能发挥抑制其增殖的作用,防止ESC增殖过快造成基因组不稳定。NFE2L3作为脊索动物特异基因可能在ESC中发挥着其较为独特的作用。总之,本课题通过生信分析和实验探究两方面结合对脊索动物特异蛋白NFE2L3在ESC中的功能进行研究,丰富了人们对脊索动物特异蛋白在胚胎干细胞中功能的认识。

摘要： 首席专家李飞武(1982-),男,汉族,博士,研究员。现任农业质量标准与检测技术研究所所长、农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心(长春)常务副主任。全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会副主任委员、中国植保学会生物安全专业委员会副主任委员、吉林省农产品质量安全学会副理事长兼秘书长。获“吉林省青年科技奖”“吉林省有突出贡献中青年专业技术人才”“吉林省拔尖创新人才”等荣誉称号。2006年工作以来,一直从事农业转基因生物安全评价与分子检测技术及标准化研究工作,主持国家转基因重大专项、生物育种重大项目、吉林省杰出青年人才项目等40余项,获省部级科技进步二等奖4项,主持和参与起草国家标准40余项,获授权发明专利7件,以第一作者或通讯作者发表论文50篇。