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关键词： 双酚A   人胚胎干细胞   胚胎毒性   神经发育毒性   毒作用机制   毒作用模式   风险评估   PBPK模型  

摘要： 双酚A（bisphenol A,BPA）是一种用途广泛的有机化合物,具有雌激素活性,可干扰内源性雌激素作用。但BPA的毒作用机制目前尚未完全阐明,同时,化学物毒作用的风险评估方法也有很大发展,由之前的“外部剂量与反应”分析为主,转换为倾向于尽可能纳入毒作用模式（mode of action,MOA）的相关数据,并将基于靶组织的毒性效应与物质活性形式的浓度相关联,提供与生物反应相关的剂量度量表示方法。基于生理学的药代动力学（physiologically-based pharmacokinetic,PBPK）模型是进行此类风险评估的有力工具。胚胎干细胞在体外培养条件下仍可自我更新和增殖,并可被诱导分化为机体几乎所有类型的细胞,已被广泛应用于器官组织移植、细胞替代治疗、化学物毒性评估等领域。欧洲替代方法研究中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods,ECVAM）于2002年正式批准了基于鼠胚胎干细胞的胚胎干细胞实验（Embryonic stem cell test,EST）,将其作为预测化学物的发育毒性作用的体外替代评价模型。但由于EST使用鼠胚胎干细胞作为测试体系,将其评价结果外推至人时,仍存在种属差异而带来一定的不确定性。且传统EST以心肌分化为观察终点,而心肌分化主要与中胚层相关,故无法检测受试物对其他胚层发育的影响。如能同时检测受试物对非心肌分化的影响,可进一步提高预测的准确性和特异性。本课题组前期对BPA的毒作用进行了生物学信息分析,结果提示BPA主要作用于性腺、胚胎和神经系统,故本研究聚焦于BPA的胚胎毒性和神经发育毒性的测试和评估,使用人胚胎干细胞H9（human embryonic stem cell-H9,h ESC-H9）替代鼠胚胎干细胞,对传统EST进行方法改进和优化,并以心肌分化和神经分化两种观察终点对BPA进行发育毒性评价,然后以建立的h ESC-H9模型探究BPA的胚胎毒性和神经发育毒性机制,将BPA浓度和毒性效应数据代入模型进行基于MOA的健康风险评估,得出BPA胚胎毒性和神经发育毒性的暴露限值,为基于毒性通路的BPA健康指导值设定和风险管理提供依据。第一部分:基于人胚胎干细胞模型评价双酚A的胚胎毒性目的:建立h ESC-H9细胞评价模型,并应用该模型评价BPA的胚胎发育毒性,以期为h ESC在毒性评价替代实验中的应用积累资料,为EST的方法优化和发展提供数据支撑,进一步提高胚胎发育毒性预测的准确性。方法:（1）胚胎分化:无滋养层培养法培养h ESC-H9,Aggre Well培养板法制备拟胚体（embryonic body,EB）,将EB进行悬浮培养使其进一步长大,转贴壁培养诱导EB自然分化;（2）神经分化:无滋养层培养法培养h ESC-H9,Aggre Well?培养板法制备EB,收集EB,诱导形成神经花环,重植神经花环形成神经祖细胞,进一步向神经元前体分化,收集神经元前体细胞,传代后贴壁培养进入神经元成熟阶段。（3）基于h ESC-H9的EST模型的建立和验证:参照传统EST标准操作步骤进行实验,并选用ECVAM推荐的已知发育毒性测试的标准阴性参照物青霉素G（Penicillin G,PN-G）和标准阳性参照物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）对模型进行验证。（4）h ESC-H9评价模型的应用:在模型验证有效的基础上,使用不同浓度BPA分别处理处于对数生长期的Balb/c-3T3和h ESC-H9细胞7天,通过细胞毒性试验检测BPA对两种细胞的半数增殖抑制浓度(50%inhibitory proliferation concentration,IC)。根据预实验结果,选用不同浓度的BPA分别处理h ESC-H9胚胎分化和神经分化的细胞10天后,使用实时聚合酶链反应（Quantitative Real-time polymerase chain reaction,q PCR）检测不同浓度BPA作用下h ESC-H9胚胎分化为心肌细胞肌球蛋白重链（alpha myosin heavy chain,α-MHC）和h ESC-H9神经细胞巢蛋白nestin基因的表达情况,拟合效应曲线,求得两种分化细胞的半数分化抑制浓度(50%inhibition of differentiation,ID)。将Balb/c-3T3和h ESC-H9的IC及两种分化细胞的ID分别代入线性判别函数公式进行计算,对BPA的胚胎发育毒性进行评价。结果:采用无滋养层培养法培养的h ESC-H9细胞生长状态良好,胚胎分化和神经分化细胞均显示了良好的分化状态。该评价模型的验证结果显示PN-G无胚胎毒性,而5-FU具有强胚胎毒性,与EC

关键词： 皂树皮皂苷   胚胎干细胞培养基   人胚胎干细胞   人脑类器官  

摘要： 背景人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有自我更新、无限增殖以及多向分化能力,这些特性使得hESCs被探索用于理解人体基础生物学、治疗各种疾病。常用的hESCs培养基为E8,其无动物源成分且成分简单,适用于hESCs大批量培养,但其中的生长因子bFGF、TGF-β价格昂贵,在培养过程中容易降解,从而导致培养基效价不足影响hESCs的培养,因此高效、低成本的hESCs培养体系对于临床和生物技术应用至关重要。皂苷类化合物广泛分布于植物界中,其中包括皂树皮皂苷(Saponin from quillaja bark,SQb),前期通过小分子药物化合物库的筛选发现皂树皮皂苷可以促进干细胞的增殖,因此希望建立一种含皂树皮皂苷的新型hESCs培养基促进低成本培养和生产hESCs用于医疗和工业应用。目的本课题拟通过筛选小分子药物替代E8培养基中hESCs生长所需关键生长因子bFGF、TGF-β,促进低成本培养和生产hESCs。方法1.无生长因子bFGF或TGF-β培养基的开发从小分子化合物库中筛选出对干细胞增殖、维持多能性有促进作用的小分子药物,将这些药物进行组合,通过细胞存活率实验、细胞增殖曲线以及干细胞标记物的表达水平,筛选出用小分子药物替代生长因子bFGF或TGF-β的新型培养体系,用于维持hESCs的长期培养。2.新型培养体系长期培养后hESCs的干性鉴定干细胞多能性标记物OCT4、NANOG、SOX2、SSEA4、TRA1-60的表达水平鉴定新型培养体系下长期培养的hESCs的多能性是否产生影响。以E6、E8作为对照组,对新型培养体系下hESCs进行RNA测序分析,分析hESCs基因表达水平。3.新型培养体系下hESCs的分化发育潜能鉴定使用诱导因子分别将新型培养体系培养下hESCs靶向为皮层和GABA类器官,观察类器官生长发育状态,以及通过特定标记物的表达水平鉴定在新型培养体系培养下hESCs的分化能力。结果1.在小分子药物中筛选出200 ng/m L皂树皮皂苷(SQb)在E8培养基中替代TGF-β,减少bFGF的用量至50 ng/m L的新型培养体系E6b S,可以维持hESCs的多能性和增殖能力。2.在E6b S培养体系长期培养下的hESCs表达OCT4、NANOG、SOX2、SSEA4、TRA1-60干细胞多能性标记物。RNA测序结果表明E6b S培养体系下hESCs的基因表达水平与E8接近。3.皮层类器官祖细胞(SOX2)、皮层分层标记物(TBR1、BRN2)的共表达,以及GABA类器官抑制性神经元祖细胞(NKX2.1、SOX6)与神经元标记物(TUJ1、MAP2)的共表达证明E6b S培养体系下hESCs的多能性未受到影响。结论皂树皮皂苷(SQb)可以替代E8培养基中的TGF-β以及降低bFGF的用量为50 ng/ml,建立了一种新型E6b S培养体系,该培养体系不仅能维持hESCs的多能性和增殖能力,并且降低培养成本,对hESCs的研究与应用转化具有重要的意义。

关键词： 聚羟基脂肪酸酯   大肠杆菌多基因共转化   CoA转移酶   PHA合酶   代谢工程  

摘要： 聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHAs）是一种由亲盐古菌和多种细菌合成,可以从植物生物量、油、糖甚至二氧化碳等可再生资源中生产的生物基塑料,具有生物相容性和可生物降解性。一些细菌如Pseudomonas savastanoi和Pseudomonas putida在含有正苯链烷酸作为碳源的培养基中可以合成芳香族聚酯作为石油衍生的芳香族聚合物如聚氯乙烯（Polyvinylchloride,PVC）和聚苯乙烯（Polystyrene,PS）的替代品应用前景广泛。因此通过基因工程手段构建具有合成与石油基PET或PS性质类似的含苯环PHA基因工程菌研究引人瞩目。本研究选择来源于Clostridium diffcile的具有催化苯环脂肪酸底物形成聚合前体的2-羟基异己酸Co A-转移酶Had ACd作为前体供给酶,选择来源于Pseudomonas aeruginosa 93-3-1的PHA合酶Pha C1Pa93及其突变体Pha C1Pa93（STQK）用于PHA聚合。根据两类酶的底物特异性分析,基于设计的PHA合成途径,构建以大肠杆菌为宿主含有重组质粒p QE-80L-had ACd-pha C1Pa93/pha C1Pa93（STQK）或p ACYCDute1-pha C1Pa93/pha C1Pa93（STQK）-had ACd的工程菌株,利用葡萄糖和含苯环的脂肪酸作为碳源培养基因工程菌,探讨其合成PHA的能力和结构。首先,利用体外重组技术过表达并提纯了HadACd和PhaC1Pa93及其突变体Pha C1Pa93（STQK）并分析了其活性和底物特异性。将扩增的基因片段分别与载体连接构建重组质粒转导入宿主获得三个重组菌BL21-p ColdⅡ-had ACd、BL21-p QE-80L-pha C1Pa93和BL21-p QE-80L-pha C1Pa93（STQK）。体外大量培养重组菌表达目的蛋白并利用6His标签并纯化,获得蛋白浓度分别为Had ACd（15.8 mg/m L）、Pha C1Pa93（3.8mg/m L）和Pha C1Pa93（STQK）（5.4 mg/m L）。三个蛋白的底物特异性分析结果表明,Had ACd对（R）-3HB、4HBZ、HPBA和（R）-MA酶活性为0.1264±0.0011 U/mg、0.1193±0.0019 U/mg、0.1595±0.0003 U/mg和0.1287±0.0023 U/mg;Pha C1Pa93仅对（R）-3HBCoA有活性,其酶比活力为0.1400±0.0002 U/mg;PhaC1Pa93（STQK）对（R）-3HBCo A、4HBZCo A、HPBACo A和（R）-MACo A酶活性为0.1371±0.0009 U/mg、0.1266±0.0012U/mg、0.0980±0.0011 U/mg和0.1548±0.0019 U/mg。其次,分别使用pQE-80L和pACYCDute-1两种质粒,构建含HadACd和Pha C1Pa93/Pha C1Pa93（STQK）的共表达载体,并在蛋白表达水平检测其表达情况。通过分子生物学手段,构建含had ACd和pha C1Pa93/pha C1Pa93（STQK）的重组质粒p QEHC、p QEHSTQK、p ACH和p ASTQKH,基因工程菌培养后菌液蛋白质表达检测结果表明,基于p ACYCDute-1构建的共表达载体p AC/STQKH在氮限制的条件下,Had ACd和Pha C1Pa93/Pha C1Pa93（STQK）蛋白能自主、稳定的同时表达。将其分别转导DH5α和XL-Blue得到稳定表达两种目的蛋白的基因工程菌DHp QEHC、DHp QEHSTQK、DHp ASTQKH和XLp ASTQKH。最后,对基因工程菌DHpACH和DHpASTQKH培养,利用1H-NMR分析合成产物的结构;并对DHp ASTQKH进行培养条件优化。DHp ACH在仅添加2%葡萄糖和额外添加（R）-3HB的条件下,合成产物的1H-NMR结果显示,均在5.3 ppm、2.6ppm和1.3 ppm处有特征峰,推测为PHB;DHp ASTQKH在仅添加2%葡萄糖、额外添加（R）-3HB和（R）-MA时,合成产物的1H-NMR结果显示,仅在5.3 ppm、2.6 ppm和1.3 ppm处有特征峰,推测为PHB,而额外添加4HBZ或HPBA时,合成产物的1H-NMR结果显示,均在0.75 ppm、1.36 ppm、1.65 ppm、2.6 ppm、5.2 ppm和5.3ppm都有特征峰,推测产物为PHBV。对DHp ASTQKH进行培养条件优化,以4m M HPBA或6 m M 4 HBZ为底物,在p H=8,

关键词： 骨关节炎   基因治疗   阳离子型含磷树状大分子   低氧诱导因子-2α   水凝胶微球  

摘要： 目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以软骨进行性退变、软骨下骨重塑、滑膜炎和骨赘形成为特征的老年退行性关节疾病。OA的发生和众多基因有着密切的关系,因此,基因治疗对于OA的治疗及软骨的再生具有重要的意义。基因治疗的核心是寻找安全、有效的基因载体将目的基因递送到特定部位发挥相应的作用,并且要构建合适的递送系统避免递送的基因失活。因此,本文首先通过迭代法合成了含磷树状大分子,并在其表面修饰哌啶并质子化,从而制备了阳离子型含磷树状大分子(Cationic phosphorus dendrimers,CPD)。然后将其用于负载和递送OA的关键治疗基因(Hypoxia inducible factor-2αsi RNA,HIF-2αsi RNA),从而制备出载体-基因复合物(CPD@HIF-2αsi RNA)。同时,利用微流控技术制备了可注射、粒径均一、单分散的甲基丙烯酸化透明质酸(Methacrylated hyaluronic acid,HAMA)水凝胶微球并通过π-π共轭的方式与CPD@HIF-2αsi RNA结合,从而创新性地构建了基因工程化的可注射HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球,通过关节腔微创注射的方式起到有效递送并缓释治疗基因的目的,有望为OA的治疗提供新的策略。本研究旨在:(1)构建CPD纳米载体用于HIF-2αsi RNA基因的负载和递送,体外对其细胞毒性、基因转染效果及基因敲低效果进行评估;(2)构建HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球,体外对其微观结构、溶胀率和降解性等性能进行相应的表征;(3)体外评估HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球的生物安全性及对软骨代谢、凋亡的影响,体外评估微球的治疗效果;(4)体内评估HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球对OA软骨损伤修复的效果。材料和方法:(1)首先通过迭代法制备含磷树状大分子,并在其表面修饰哌啶并质子化,从而制备出CPD纳米载体。然后通过静电吸附作用将CPD与治疗OA的关键基因HIF-2αsi RNA复合,从而构建了具有沉默HIF-2α效果的CPD@HIF-2αsi RNA复合物。随后,通过琼脂糖凝胶电泳实验评估了CPD对HIF-2αsi RNA的负载效率,通过Zeta电位测定了不同N/P比的CPD@HIF-2αsi RNA复合物的表面电势,通过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)检测了CPD和CPD@HIF-2αsi RNA复合物的微观结构及粒径,通过荧光显微镜观察、流式细胞检测和实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测评估了不同N/P比的CPD@HIF-2αsi RNA复合物的转染效率及对HIF-2α基因的敲低效果,通过活/死细胞染色和细胞计数(Cell counting kit-8,CCK-8)评估了不同N/P比的CPD@HIF-2αsi RNA复合物的细胞毒性,通过体外软骨渗透实验评估了CPD@HIF-2αsi RNA复合物在不同p H条件下的软骨渗透能力。(2)通过微流控技术将HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA混合溶液制备成大小比较均匀的预凝胶液滴,然后在紫外光下发生自由基聚合反应,从而固化形成基因工程化的可注射HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球。接着,我们通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)检测、体外溶胀实验、体外降解实验等实验对HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球进行相关的表征。(3)通过活/死细胞染色、CCK-8、鬼笔环肽染色、RT-q PCR、免疫荧光染色和TUNEL染色等实验评估了HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球的生物相容性及对软骨代谢和凋亡的影响,体外评估了该微球的治疗效果。(4)通过关节腔注射单碘乙酸的方法构建了OA小鼠模型,然后通过关节腔微创注射水凝胶微球的方式对其进行干预。8周后分别进行大体观察、X线检查、微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography,Micro-CT)检查、苏木素-伊红(HE)染色、番红固绿染色和免疫组织化学染色来评估HAMA@CPD@HIF-2αsi RNA水凝胶微球促进OA软骨损伤修复的效果。结果:(1)CPD能够很好的负载HIF-2αsi RNA并且具有较高的转染效率,同时能够有效地敲低HIF-2α的表达。当N/P=2时,CPD能够完全负载HIF-2αsi RNA;当N/P=20时,CPD仍然具有较好的生物相容性,同时具有最佳的转染效率和敲低HIF-2α的效果。此外,CPD@HIF-2αsi RNA复合物在弱酸性条件下(p H=6.6)

关键词： 平滑肌细胞   胚胎干细胞   转录因子Pbx1   Epas1  

摘要： 平滑肌由负责血管收缩和细胞外基质生成的平滑肌细胞组成,其表型转换与包括动脉粥样硬化、高血压在内的多种心血管疾病相关。Pbx1基因是一种TALE同源域转录因子,该基因编码转录因子的PBX同源盒家族,在胚胎发育及器官发生过程中扮演着重要角色。实验室利用建立的胚胎干细胞定向分化为平滑肌细胞(ESC-SMC)体外分化模型,结合RNA-Seq数据分析,我们发现Pbx1可能参与平滑肌细胞分化进程。通过构建纯合敲除Pbx1基因的ESC细胞株,进一步表明Pbx1敲除导致平滑肌细胞分化受到抑制。本研究通过慢病毒转染法构建了Pbx1过表达的ES细胞株,利用ESC-SMC分化模型,进行表型观察及SMC标志基因的表达检测,证明Pbx1过表达促进了ES细胞向SMC分化。为了初步探究其涉及的分子机制,我们利用RNA-Seq数据、JASPAR数据库及文献分析,结合q PCR验证,筛选出数个Pbx1的候选靶基因,随后设计双荧光素酶实验和点突变实验验证其作用模式,现有的数据表明Pbx1基因促进SMC分化并非直接靶向Epas1基因。此外,我们还利用另一个SMC体外分化模型(10T1/2细胞)对Pbx1的功能进行了验证,结果显示过表达Pbx1足以促进10T1/2细胞向平滑肌样细胞分化,MTT实验表明Pbx1过表达还可促进10T1/2细胞的增殖。综上所述,我们的研究证明Pbx1在SMC分化过程中起重要的促进作用,这一发现可为平滑肌分化的机制研究及心血管疾病的药物开发和临床治疗提供参考。

关键词： 白三烯B4   人胚胎干细胞   造血分化   红系分化  

摘要： 研究背景:红细胞（Red Blood Cells,RBCs）输注是改善多种原因所致贫血的主要治疗方式,具有重要的临床应用价值,但由于资源有限、保存周期较短、输血相关疾病传播风险等限制,目前国内外的红细胞供应均十分紧张,且存在多种输注风险,而利用干细胞制备红细胞用于临床有望成为未来血液供应和保障的新模式。作为红细胞体外制备的起始种子细胞,人胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells,h ESCs）相对于成体的造血干细胞具有更强大的自我更新能力和三胚层分化潜能,能够大规模扩增,是获得大量红细胞的理想种子细胞。然而体外诱导h ESCs生成的培养红细胞（cultured Red Blood Cells,c RBCs）目前还难以成为临床级使用的血液制品,其最大的障碍莫过于c RBCs的体积大,脱核率低,表达胎儿型血红蛋白（Fetal Hemoglobin,Hb F）。大量研究表明除外周血（Peripheral Blood,PB）来源c RBCs外,多能干细胞来源c RBCs均缺乏成人型血红蛋白（Adult Hemoglobin,Hb A）的表达。因此,为了探究不同来源c RBCs的这些差异和功能不成熟的原因,更好地用于多能干细胞体外制备红细胞,课题组将不同来源c RBCs进行了甲基化芯片分析,从基因水平分析c RBCs功能不完善的原因。通过分析发现在h ESCs来源c RBCs（h ESCs-c RBCs）中发生超甲基化同时又在PB来源c RBCs（PB-c RBCs）中发生低甲基化的位点（Ery-DMS-h ESCs+/PB-）同时出现差异性P值最小、且富集度最高的分子——白三烯B4（Leukotriene B4,LTB4）受体:包括LTB4R和LTB4R2。LTB4R和LTBR2是LTB4下游的受体,而LTB4是由花生四烯酸经过多个步骤产生的,该途径还同时产生了LTC4等其他白三烯亚型。而花生四烯酸的另外两条代谢通路,细胞色素P450、环氧合酶（COX）途径的代谢产物羟基二十碳四烯酸（HETEs）和前列腺素E2（PGE2）已经被多篇文献报道,表明其可以促进造血干/祖细胞（Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs）的生成及红细胞的发育。研究表明LTB4可以促进人脐带血（Umbilical Cord Blood,UCB）来源CD34+HSPCs增殖和向粒系分化,并且具有抗凋亡的作用。而LTB4和LTC4、LTD4等其他白三烯亚型也可以促进小鼠和斑马鱼的造血细胞生成。在白三烯对其他的调控研究中发现,LTB4可以促进小鼠胚胎干细胞诱导体系中血管的生成。而根据课题组比对不同来源c RBCs的LTB4受体差异甲基化和表达,发现LTB4R和LTB4R2在h ESCs-c RBCs中高甲基化,低表达,在PB-c RBCs中低甲基化,高表达。因此,我们推测在体外诱导培养体系中通过添加LTB4可能改变这种差异,从而促进h ESCs-c RBCs的发育和成熟。研究目的:基于上述的分析和问题的提出,本研究旨在深入探究LTB4是否促进h ESCs向红细胞的分化及成熟,以及其作用的机制,从而优化红系细胞诱导方案,促进h ESCs-c RBCs的发育成熟和功能发挥。研究方法:为确定LTB4在h ESCs向红细胞发育和成熟调控中的关键作用,首先通过调整细胞接种密度,提高h ESCs-c RBCs诱导体系的扩增效率,并通过实时定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）实验观察LTB4受体在h ESCs-c RBCs诱导体系中的表达变化。其次在诱导体系不同阶段中添加LTB4或LTB4代谢通路抑制剂,判断LTB4对红系分化成熟的影响及作用细胞谱系;细胞经流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）、表型分析、造血集落形成实验、RT-q PCR、瑞氏-姬姆萨染色完成成熟程度的比较。接着通过细胞转录组测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）分析、生物信息学预测判断LTB4作用于其受体后影响的下游信号通路,通过筛选差异表达基因,对筛选出的差异表达基因进行GO（Gene Ontology）,KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）及PPI（Protein-Protein Interaction Networks）分析,明确LTB4作用机制。最后在UCB来源单个核细胞（UCB-Mononuclear Cell,UCB-MNCs）向红细胞诱导的体系中添加LTB4,验证LTB4对红系分化成熟的影响;通过调整LTB4的作用阶段分析LTB4在UCB来源c RBCs（

关键词： 草甘膦   耐草甘膦基因   草甘膦残留   转基因作物  

摘要： 草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂,自1974年商业化以来,由于其具有低成本、高效率、易降解及环境影响小等特点而在农业生产中广泛使用。特别是二十世纪八十年代以来,伴随着国际上耐草甘膦转基因作物的推广所带来的经济效益,草甘膦的使用量急剧上升。长期使用单一除草剂使得全球范围内产生了许多抗性杂草。在对受到草甘膦污染的土壤微生物及抗性杂草的研究中,发现了不同生物体内多种草甘膦抗性策略,如突变或过表达草甘膦靶位点EPSPS、GAT乙酰化修饰草甘膦、依赖转运体(ABCC8)转运草甘膦至质膜外、GOX氧化降解草甘膦等降低草甘膦对作物损伤的策略。然而,鉴于目前的耐草甘膦转基因作物以过表达CP4 epsps基因为主,自主知识产权的耐草甘膦基因资源不足。同时,人们对作物中的农药残留问题也越来越关注。挖掘新的耐草甘膦基因资源,创制草甘膦高耐受性和低残留量的转基因作物具有重要意义。本研究利用生物信息学分析,通过定性和定量实验,筛选出一个具有草甘膦高耐受性的GAT家族基因GAT3及其2个突变基因(m GAT3-77和m GAT3-62);并以其为主要效用基因,辅以ABCC8基因和GR79 epsps基因,创制草甘膦高耐受和低残留的转基因玉米材料。具体研究结果如下:(1)耐草甘膦基因资源的挖掘。从Pfam数据库中获取3043条GAT家族基因序列,通过聚类分析从中选取18条基因序列进行草甘膦耐受性分析。经过平板定性分析、MIC测定以及生长曲线测定,筛选到一个具有草甘膦高耐受性潜力的基因,命名为GAT3。(2)为了进一步提高GAT3的草甘膦耐受性,根据上述筛选结果,对18条基因序列按耐受性高低进行排序,分析可突变的氨基酸位点及氨基酸种类。由此获得12个GAT3单突变基因并再次进行草甘膦耐受性分析,筛选出草甘膦耐受性显著提升的m GAT3-77(V77M)和m GAT3-62(E62G)突变基因。(3)根据单突变菌株的筛选实验结果,分别以V77M和E62G为基础突变位点,将其余部分的突变位点向其序列中进行组合,获得21个组合突变基因。然而,经过实验筛选并未获得耐受性显著性提高的突变基因。(4)构建了以GAT3及其突变基因为主,以ABCC8基因和/或GR79 epsps基因为辅的34个玉米遗传转化载体。通过农杆菌介导玉米遗传转化,已分别获得含有单个、两两组合及三个抗性基因组合的19个遗传转化载体衍生的T0代转基因玉米,共162个转化事件。转基因玉米材料的草甘膦耐受性分析及残留量分析尚在进行。本研究希望挖掘新的耐草甘膦基因资源,并以GAT3或其突变基因为核心,融合GR79 epsps、ABCC8基因的组合抗性策略来创制草甘膦耐受性高且残留量低的转基因玉米材料。同时,为大豆、油菜、水稻等作物提供一种新的耐草甘膦策略。

关键词： 无义介导的mRNA降解   UPF3A   NMD抑制因子   胚胎干细胞  

摘要： 无义介导的 mRNA 降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径是真核生物细胞中高度保守的基因转录后调控机制。作为mRNA的质量监控机制,NMD可以识别并降解含有提前终止密码子(Premature termination codon,PTC)的异常转录本,防止有害截短蛋白的产生;另一方面NMD调节细胞内3%-10%的正常转录本的丰度,在细胞发育、机体应激、免疫调控等过程中发挥重要作用。UPF3(Up-frame shiftprotein3)是NMD的核心因子之一,在单细胞真核生物和无脊椎动物中只存在一个编码基因。随着脊椎动物的产生,UPF3通过一次基因复制事件产生了两个旁系同源物(Paralogs),分别为UPF3A和UPF3B,二者结构保守,均具有N末端的RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM)和C末端的外显子连接复合物结合基序(EJC-binding motif,EBM)。其中,UPF3B是被广泛认可的NMD激活因子。现有研究对UPF3A在NMD中的功能和作用模式存在争议。早期观点认为UPF3A是微弱的NMD激活因子,然而近期研究指出UPF3A是小鼠NMD通路的抑制因子。为了深入探究UPF3A在小鼠NMD通路中的功能,本研究通过CRISPR-Cas9技术构建了Upf3a条件性敲除小鼠品系(Upf3aF/F),通过与CreERT2+小鼠交配,得到了Upf3a诱导型敲除小鼠(Upf3aF/F CreERT2+)。我们分离和建立了 6株Upf3a诱导型敲除小鼠胚胎干细胞系,通过对其进行4-OHT(4-Hydroxytamoxifen)药物诱导,最终建立了可稳定遗传的Upf3a敲除型胚胎干细胞系。与此同时,我们成功构建了 4株小鼠肋骨处肌肉组织来源的Upf3a敲除型成纤维细胞系。研究结果表明,Upf3a的敲除不会改变小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞的活力,且在Upf3a敲除型小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞中,经典NMD分子靶标的转录本水平均没有下调。通过对Upf3a诱导型敲除成年小鼠注射他莫昔芬,我们获得了敲除Upf3a的各个组织样品。在缺失UPF3A的小鼠肝脏中,NMD靶基因如Atf4、Snhg12、Snord22、1810032O08Rik和Hnrnpl的转录本水平显著性上调,而NMD靶基因如Auf1、Gas5、Eif4a2的转录本具有上调的趋势。在缺失UPF3A的小鼠胸腺中,Auf1表达量显著上调,同时 Smad5、Gas5、Snord22、Hnrnpl、Ddit3和Eif4a1的转录本水平有上调的趋势。在缺失UPF3A的肝脏和胸腺组织中,所检测的经典NMD靶基因的表达均没有下调。在缺失UPF3A的脾脏中,Cdh11的表达显著上调,Atf4和Ddit3的表达显著下调,其他16个NMD靶标的转录本水平与对照组相比,没有显著性差异。综上,本论文研究结果表明,在小鼠胚胎干细胞和成纤维细胞中,UPF3A并不是NMD抑制因子。在小鼠肝脏、胸腺、脾脏等主要组织中,UPF3A作为激活因子,微弱且选择性地正向调控特定NMD靶标的mRNA稳定性。Yi和Wallmeroth等人同时发表的两项新发现与本论文结论相互印证,支持“UPF3A和UPF3B功能冗余,均是哺乳动物中NMD激活因子”的观点。

关键词： 动态培养   巨核细胞   人胚胎干细胞   线粒体功能  

摘要： 血小板输注是临床上预防和治疗血小板减少症的有效方法之一,已被广泛用于肿瘤放化疗及造血干细胞移植后相关病症出现的治疗方案中。临床上,血小板的供应主要依赖于志愿者捐献,由于存在捐献者数量有限、采集的血小板保存期短、存在病原微生物污染风险等诸多限制因素,导致血小板应用存在供需严重失衡的问题。巨核细胞是血小板的前体细胞,体外基于干细胞技术制备巨核细胞及血小板是解决血小板来源短缺的新途径。人多能干细胞具有强大的自我更新能力和向三个胚层组织细胞分化的潜能,是体外制备巨核细胞和血小板制品的理想种子细胞来源。目前,已有多个研究团队成功构建了人多能干细胞向巨核细胞及血小板分化的方案。然而,如何实现人多能干细胞来源巨核细胞和血小板的规模化、高效制备依旧是一个巨大的挑战。方法:（1）构建人胚胎干细胞向巨核细胞诱导分化的分阶段诱导体系,筛选比较静态、动态培养体系和动态培养体系中摇床转速等参数变化对巨核细胞的生成效率及产量的影响,获得由人胚胎干细胞高效制备巨核细胞的三维动态培养体系。（2）利用流式细胞术、RT-q PCR、瑞氏-姬姆萨染色等实验分析动态培养模式下人胚胎干细胞来源巨核细胞的表型及生物学特征,并通过多倍体化检测、体外诱导生成血小板的实验等进一步分析人胚胎干细胞衍生的巨核细胞的生物学功能。（3）利用流式细胞术、造血集落形成、转录组测序、线粒体功能分析等技术深入探究特定动态培养模式对于人胚胎干细胞向造血祖细胞命运及巨核细胞命运选择的影响,并分析动态培养模式在人胚胎干细胞向巨核细胞命运特化中的潜在分子机制。结果:我们建立了一个由折流培养瓶和轨道旋转器组成的动态培养系统,并证明了在95 rpm条件下,人胚胎干细胞经12天的诱导周期,产生表达CD41a+巨核细胞的效率及产量明显高于静态培养体系及60 rpm、130 rpm培养条件。动态培养系统中人胚胎干细胞生成的巨核细胞高表达巨核标志性基因（PF4、THBS1、FLI1、NFE2等）及蛋白（CD41a、CD61、CD42b）,并具有典型的巨核细胞形态及超微结构特征,可进一步分化产生>16N倍性巨核细胞、前血小板和血小板。此外,我们建立的这一特定的动态培养系统能够显著提高人胚胎干细胞向生血内皮细胞及造血祖细胞的分化效率,并增强早期分化细胞的巨核分化偏向性。在机制研究方面,我们发现该动态培养系统能够显著提高培养体系中的溶氧水平,增强了细胞的线粒体功能,并促使细胞通过氧化磷酸化途径产生更多的ATP,促进巨核细胞特征基因MPL、RUNX1、PF4、THBS1的表达,从而增强了巨核细胞生成的命运。结论:本研究构建了一套基于折流培养瓶和轨道旋转器组成的动态培养系统,实现了人胚胎干细胞向巨核细胞的高效制备;揭示了该系统通过增强细胞线粒体功能进而促进巨核细胞生成相关基因表达、促进巨核细胞命运选择的分子机制。本研究将有助于利用生物反应器体外规模化制备人胚胎干细胞来源功能性巨核细胞及血小板制品,并为其应用于临床血小板减少症治疗提供技术支撑。

关键词： 胶质瘤   基因工程鼠伤寒沙门氏菌   铁死亡   GPX4  

摘要： 研究背景:众所周知,胶质瘤是中枢神经系统恶性肿瘤中最常见的肿瘤,其侵袭性和复发性是胶质瘤治疗的主要障碍,迫切需要寻找新的治疗方法。细菌肿瘤治疗是一种潜在的治疗胶质瘤的方法,特别是鼠伤寒沙门氏菌目前研究最广泛。铁死亡是一种新的细胞死亡方式,其不同于凋亡和坏死等死亡形式。但是,基因工程鼠伤寒沙门氏菌是否可以通过诱导铁死亡来抑制胶质瘤的生长目前仍不清楚。目的:探究基因工程鼠伤寒沙门氏菌是否可以抑制胶质瘤生长及其具体机制。方法:采用免疫荧光和透射电镜观察专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后的侵入情况。不同浓度的专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后,用CCK-8方法检测共培养后细胞活力的变化。mRNA转录组测序分析专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后,胶质瘤细胞内基因表达的变化情况。采用活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测试剂盒检测专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后胶质瘤细胞内ROS、MDA和GSH/GSSG的水平。采用透射电镜观察专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后细胞线粒体形态的变化。加入铁死亡抑制剂后再次观察上述指标。采用qPCR和Western blot方法检测专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后细胞内谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX4)的表达水平。尾静脉注射不同浓度的专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1后,每天观察裸鼠的体重变化,并确定体内注射专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1的最适浓度。采用皮下成瘤的方法构建裸鼠胶质瘤皮下模型。尾静脉注射最适浓度的专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1后,每天观察不同组裸鼠的肿瘤大小。采用MDA和GSH/GSSG检测试剂盒检测不同组的肿瘤组织中MDA和GSH水平。采用免疫荧光检测不同组的肿瘤组织中GPX4蛋白的表达水平。最后,用免疫荧光和透射电镜观察专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1是否可以定植到肿瘤组织。免疫荧光和HE染色观察专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1在其他组织的定植情况和对其他组织的毒性。结果:免疫荧光和透射电镜结果显示不同浓度的专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与细胞共培养后可以穿过细胞膜,以个体或聚集的形式存在于细胞质中。CCK-8结果显示专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1可以明显抑制胶质瘤细胞的活力,且具有浓度依赖性。专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养后可以诱导胶质瘤发生铁死亡,其与GSH和谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX4)水平降低有关。同时,胶质瘤细胞内MDA和ROS水平升高,这些指标都是铁死亡的重要标志。此外,透射电镜观察发现胶质瘤细胞线粒体萎缩,线粒体膜密度增加。在专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1与胶质瘤细胞共培养中加入铁抑素-1(Fer-1)后——一种典型的铁死亡抑制剂,胶质瘤细胞内ROS、MDA水平明显下降和GSH水平明显升高。进一步的体内实验表明,专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1可在肿瘤组织中定植并且明显抑制胶质瘤的生长。结果表明,专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1组肿瘤生长明显慢于对照组和Fer-1组,其与GPX4蛋白表达降低、脂质过氧化水平升高有关。同样地,Fer-1可以部分逆转专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1抑制肿瘤生长的效果。结论:(1)专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1可以侵入肿瘤细胞并且抑制肿瘤细胞活力。(2)体外实验证明,专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1可以导致细胞内ROS和MDA的升高和下调GSH水平和GPX4蛋白的表达,从而诱导铁死亡的发生。(3)体内实验进一步证明,专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1可以诱导胶质瘤发生铁死亡,从而抑制胶质瘤的生长。这些数据说明,铁死亡是专性厌氧鼠伤寒沙门氏菌YB1抑制胶质瘤生长的机制之一,可能是提高细菌疗效的潜在靶点。