关键词：
疫霉菌抗性
转基因作物
RXLR效应子
PI3P
PAs
摘要：
卵菌门疫霉属（Phytophthora）有近200个种,引起多种作物病害,持续对全球农业生态系统和粮食安全构成重大威胁。历史上,致病疫霉（***）引起马铃薯晚疫病,造成爱尔兰大饥荒,如今依然是马铃薯上的主要病害;大豆疫霉（***）引起大豆疫霉根腐病,是大豆上的重要病害。选育抗病品种是一种控制作物疫病的有效手段。转基因抗病育种能够实现物种间的基因转移,拓宽遗传资源的利用范围,实现已知功能基因的定向高效转移。虽然已经有很多成功的转基因抗病育种案例,但在转基因抗病育种中,抗病性的提升往往导致作物自身生长发育受损,即植物抗病性具有适应度代价（fitness cost）。挖掘有效的精准抗病育种的控制靶标,提高作物抗病且最大限度地减少对生长的负面影响迫在眉睫。
前期研究表明,疫霉菌在侵染寄主的过程中会分泌大量的效应蛋白,干扰植物的正常生理生化过程,促进侵染。其中一类RXLR（Arg-X-Leu-Arg,X代表任意氨基酸）效应蛋白能够结合细胞膜上的PI3P（Phosphatidlyinositol 3-phosphate）促进它们向寄主细胞中转运,增加它们在寄主细胞中的稳定性。本实验室前期研究工作表明,在植物质外体中表达分泌型PI3P特异性结合肽FYVE,通过FYVE与PI3P结合,隔离RXLR效应子与PI3P的结合,从而干扰了疫霉菌的致病性,提高了植物的抗病性。同时,植物中的PAs（Polyamines）参与植物免疫反应对抗病原菌,尤其是通过产生活性氧（Reactive oxygen species,ROS）来放大PTI（Pattern-triggered immunity）反应。以此为基础,本研究提出设想,认为PI3P和PAs可以作为设计精准转基因抗病育种的靶标。我们针对PI3P和PAs这两个在植物与病原菌互作过程中发挥重要功能的化合物设计了三种转基因抗病育种方式,并取得以下主要结果:
1.杀菌蛋白靶向疫霉菌菌丝表面以增强杀菌活性来提高作物对疫霉菌的抗性
本实验室前期研究表明,疫霉菌在感染寄主的过程中也可以合成PI3P,有助于RXLR效应子发挥毒性功能。且以疫霉菌产生的PI3P为靶标,设计了PI3P特异性结合肽FYVE与杀菌蛋白GAFPs的融合蛋白,发现FYVE能引导杀菌蛋白向疫霉菌侵染菌丝周围聚集,提高了杀菌蛋白的活性,赋予了植物强抗病能力。本研究以此为基础,成功制备了转基因大豆材料,通过离体叶片接种和活体盆栽接种两种方法,发现SP-GAFPs-FYVE对大豆疫霉P7076的抗性显著高于SP-GFP-FYVE对大豆疫霉P7076的抗性,表明FYVE融合GAFPs后能通过结合PI3P精准靶向侵染菌丝,增强杀菌活性,提高植物强抗病性。同时,本研究选择了不同遗传分支的两个大豆疫霉菌株PS14和PS15进行接种实验,结果显示SP-GAFPs-FYVE也能够显著增强大豆对PS14和PS15的抗性,表明SP-GAFPs-FYVE赋予大豆广谱抗性。此外,我们还制备了转基因马铃薯材料,分别使用离体单叶、离体复叶和活体整株三种接种方法证明了转基因马铃薯对两个致病疫霉菌株MZ15-30和PD11218具有显著的抗性,表明SP-GAFPs-FYVE赋予的抗性在多个作物中都能发挥功能。同时,转基因大豆和马铃薯的农艺性状并没有发生改变,表明我们在实现抗病的同时没有对作物自身生长造成不利影响。
2.代谢疫霉菌产生的PI3P能提高作物对疫霉菌的抗性
本研究提出设想,使用PI3P代谢酶降低PI3P的积累,可能通过干扰疫霉菌的致病能力,使得作物对疫霉菌的抗性提高。前期研究表明,拟南芥磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶1（At PIP5K1）可以将PI3P磷酸化为PI（3,4）P2。本研究中,我们建立了通过在植物中表达分泌型At PIP5K1代谢疫霉菌衍生的PI3P提高植物抗病性的育种方式。我们将At PIP5K1与大豆PR1a信号肽融合（SP-PIP5K1）,使其能够分泌到植物质外体中。表达SP-PIP5K1的转基因大豆和马铃薯植物分别对不同的大豆疫霉和致病疫霉菌株表现出显著的抗性。SP-PIP5K1显著降低了大豆与大豆疫霉互作过程中PI3P的积累。敲除或抑制大豆中PI3激酶（PI3 kinases,PI3Ks）后,损害了SP-PIP5K1介导的抗性,表明疫霉菌衍生的PI3P对SP-PIP5K1的作用是必要的。此外,我们发现SP-PIP5K1可以干扰由RXLR效应子Avr1k介导的大豆疫霉的功能。这种新的病害防控策略是通过代谢PI3P来干扰RXLR效应子的功能,从而在作物中赋予广谱的疫霉菌抗性。
3.代谢大豆中的PAs增强大豆对疫霉菌的抗性且不影响大豆自身生长
PAs能够参与植物免疫反应,在植物与病原菌互作中发挥着重要的作用。发现大豆疫
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