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关键词： 胚胎干细胞   Atl3   多能性维持   胚层分化  

摘要： 胚胎干细胞主要是指分离于哺乳动物胚胎发育囊胚期内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)的一类细胞,它们具有自我更新能力(Self-Renewal)和发育多能性(Pluripotency)。胚胎干细胞应用前景广泛,可用于生产人类器官移植材料、生产克隆动物、遗传育种等。以往对胚胎干细胞的研究大多聚焦于多能性信号通路和转录网络,而内质网相关基因在胚胎干细胞发育中的功能研究还不全面,其中Atl3(Atlastin GTPase 3)是编码类似动态膜GTP酶家族的成员,主要定位于高度弯曲的内质网膜,Atl3相关突变(Y192C和P338R)会诱导I型遗传性感觉和自主神经病变,Atl3突变对细胞内质网形态发生有重大影响,进而扰乱了正常的内质网膜动力学,影响了内质网在细胞中的分布。研究Atl3对胚胎干细胞发育的影响有助于理解内质网相关基因对胚胎命运调控的作用。本文将结合内质网膜上的驻留蛋白Atl3基因和胚胎干细胞,围绕Atl3在mESCs(Mouse Embryonic Stem Cells)的生长发育中对多能性维持与失去的影响展开研究。首先,我们探索了过表达Atl3在R1-ESCs多能性维持过程中的影响,发现过表达Atl3对R1-ESCs多能性维持并无明显影响。随后我们构建了Atl3的shRNA载体,发现在多能性维持阶段,R1-ESCs和OG2-ESCs敲低Atl3后,细胞形态发生了明显变化:克隆整体呈扁平状,细胞-细胞间粘连减少,成团克隆中单个细胞的边界清晰,传代后表型依然如此,不存在细胞系差异。而在胚胎发育过程中发生的上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)有助于细胞在胚胎中的移动,经检测,敲低Atl3后R1-ESCs和OG2-ESCs出现的细胞-细胞间粘连减少并非由EMT介导。mESCs保持圆润克隆状是其维持多能性的一个标志,我们发现在多能性维持阶段敲低Atl3使R1-ESCs的Nanog、Oct4的表达在m RNA和蛋白水平略微升高;代表着mESCs更好多能状态的na(?)ve标志基因Esrrb、Stella的表达水平也同时升高。根据敲低Atl3后R1-ESCs和OG2-ESCs的形态表型推测,敲低Atl3后很可能会促进R1-ESCs在多能性维持阶段往神经细胞方向分化,相互印证的q-PCR和WB结果证实,神经细胞标志基因Pax6、Nestin的表达水平确有所提高,敲低Atl3后R1-ESCs能促进其往神经细胞方向分化。有研究指出,Pax6过表达可以抑制mESCs的增殖,诱导细胞周期停滞,因此我们接着检测了在多能性维持阶段敲低Atl3后R1-ESCs的细胞周期和细胞凋亡,发现敲低Atl3的R1-ESCs处于G1期的细胞增加;处于G2/M期的细胞减少;细胞凋亡水平并无明显变化,这说明敲低Atl3的R1-ESCs细胞总数的减少是由于细胞周期的变化所导致的。接着我们探索了在R1-ESCs分化过程中Atl3的转录水平,用mES培养基以悬滴的方式培养EB球,发现Atl3的转录水平随着EB分化进程的推进而逐渐增加。在R1-ESCs EB分化阶段,敲低Atl3后,D6时细胞团的边缘模糊不规则且周围细胞变为扁平状,透光性强;通过q-PCR检测发现,中胚层基因的表达在D6普遍被抑制,外胚层基因Pax6在D6被明显促进。Pax6是神经外胚层的标志基因,关系到神经元特异性基因的表达。敲低Atl3的R1-ESCs在多能性维持和EB分化阶段Pax6的表达水平均上调,说明敲低Atl3会影响ESCs向神经方向分化。我们将在接下来的实验中继续探索,在R1-ESCs定向神经分化的过程中,敲低Atl3的具体影响。最后我们进行了机制上的探索,对多能性维持阶段敲低Atl3的R1-ESCs进行RNA-Seq。通过GO分析发现,差异分析中下调的基因涉及的信号通路有TGF-β信号通路,上调的基因涉及的信号通路主要是c AMP信号通路,我将继续探索Atl3是如何通过调控内质网的动态变化而影响细胞命运决定的具体分子调控机制。综上,在多能性维持阶段,过表达Atl3对R1-ESCs多能性维持没有明显作用;R1-ESCs和OG2-ESCs敲低Atl3后,细胞形态呈扁平状且游离松散且细胞与细胞间连接减少并非由EMT介导;R1-ESCs多能性基因和na(?)ve标志基因表达水平升高;细胞周期有所改变,G1期细胞增加,G2/M期细胞减少,细胞增殖能力减弱;并且促进了R1-ESCs往神经细胞方向分化;而在EB分化阶段,Atl3的转录水平随着EB分化进程的推进而逐渐增加;敲低Atl3后抑制R1-ESCs中胚层表达。

摘要： 首席专家李飞武(1982-),男,汉族,博士,研究员。现任农业质量标准与检测技术研究所所长、农业农村部农产品及加工品质量监督检验测试中心(长春)常务副主任。全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会副主任委员、中国植保学会生物安全专业委员会副主任委员、吉林省农产品质量安全学会副理事长兼秘书长。获“吉林省青年科技奖”“吉林省有突出贡献中青年专业技术人才”“吉林省拔尖创新人才”等荣誉称号。2006年工作以来,一直从事农业转基因生物安全评价与分子检测技术及标准化研究工作,主持国家转基因重大专项、生物育种重大项目、吉林省杰出青年人才项目等40余项,获省部级科技进步二等奖4项,

关键词： 小鼠胚胎干细胞   干性维持   分化   辐射   p53家族  

摘要： 随着疾病诊断与治疗过程中放射性设备的广泛应用,辐射对人体健康的影响日益受到关注,例如导致胎儿发育畸形和孕妇流产等。然而,辐射影响生殖发育的分子机制尚不清楚。胚胎干细胞因具有自我更新和发育全能性的特点成为研究生殖发育的重要模型。本课题旨在探究辐射对小鼠胚胎干细胞干性维持和分化的影响,并进一步研究其潜在的分子机制。本研究使用Rad source RS-2000 Pro X射线仪对小鼠胚胎干细胞进行辐照处理,辐照剂量为8 Gy。我们通过qPCR和Western blot技术检测干性和分化基因的表达,结果显示,辐射会下调干性因子OCT4、SOX2、NANOG的蛋白表达水平,而其mRNA水平没有明显变化;同时,辐射上调内胚层分化基因Gata6、Gata4、Sox1 7,中胚层分化基因T、Mixl1以及外胚层分化基因Fgf5的表达。此外,通过碱性磷酸酶染色实验,我们发现,辐照后细胞的克隆形成能力减弱,分化水平增强。因此,本研究表明,辐射影响小鼠胚胎干细胞的干性维持,促进其向三胚层的分化。我们采用RNA-seq、ChIP-seq和ChIP-qPCR等技术进一步探究了辐射引起小鼠胚胎干细胞分化的分子机制,结果显示,辐照后胚胎干细胞中WNT通路的关键因子Wnt3、Wnt3a和β-catenin;及WNT通路的靶基因Cdx1、Sp5、Msx2、Axin2、Ctnnb1表达明显上调,抑制WNT信号通路会恢复辐射所促进的三胚层分化。因此,我们的研究表明,辐射激活WNT信号通路活性,促进胚胎干细胞向三胚层的分化。本研究进一步探究了辐射调控OCT4及WNT信号通路的机制,我们发现辐射后胚胎干细胞中泛素化酶基因Itch和Trim32以及p53家族基因表达上调。进一步实验显示,过表达p53家族基因会导致泛素化酶基因及WNT信号通路中关键因子Wnt3、Wnt3a表达上调,核心干性因子OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平下降,三胚层分化基因的表达上调。我们将Trp63/Trp73双基因敲除的细胞系进行辐射处理。qPCR结果显示,泛素化酶基因、WNT信号通路关键因子、及其靶基因在辐射条件下的表达水平得到恢复。此外,内胚层分化基因的表达也得到恢复。在Trp63/Trp73双基因敲除的细胞系中添加Trp53的抑制剂(PFT-α)以抑制p53家族基因的功能,然后进行辐照处理。qPCR结果显示,辐照条件下中、内胚层分化基因的上调均得到恢复。因此,辐射通过上调p53家族的表达,激活泛素化酶基因、WNT信号通路活性,进而导致胚胎干细胞的分化。此外,在辐射条件下,Hippo信号通路中的关键因子Yap及其靶基因在辐照后的表达明显上调,诱导Yap过表达可以上调胚胎干细胞三胚层分化基因的表达,下调干性相关因子的表达,促进胚胎干细胞向三胚层的分化。综上所述,本研究探索了辐射对胚胎干细胞分化的影响及其分子机制。本研究发现,辐射通过上调p53家族基因的表达,促进泛素化酶基因的表达,导致OCT4的蛋白水平下降,从而促进小鼠胚胎干细胞向内、外胚层分化。另一方面,p53家族会激活WNT信号通路活性,促进小鼠胚胎干细胞向三胚层的分化。此外,辐射会激活Hippo信号通路中YAP的活性,促进胚胎干细胞向三胚层的分化。本研究将有助于加深理解辐射对胚胎发育的影响,从而为人类优生优育,健康生活提供帮助。

关键词： 实验动物   无菌基因工程   隔离器   胚胎移植  

摘要： 目前，基因工程动物是人类探究人与动物基因功能的重要工具。然而，随着宏基因组学、代谢组学等多组学分析技术不断发展成熟，人们发现微生物在动物生理、代谢、免疫三个层面的研究中都具有巨大潜力，同时微生物组与宿主基因组之间并不独立发挥对表型性状调节的作用，而是具有复杂互作关系。这使研究学者探索基因功能时，不能轻易忽视体内微生物的存在。因此，为了更好地研究微生物与宿主基因之间的互作关系，无菌基因工程小鼠是核心工具。然而，目前无菌基因工程小鼠品种数量稀少，究其根本原因是无菌小鼠制备方法子宫切除术在制备无菌基因工程小鼠时必须分两步进行，导致成本高、耗时较长、制备效率偏低，而在无菌小鼠常规软质隔离器中无法在严格污染控制前提下进行胚胎移植无菌制备操作。因此本研究旨在创制一种可以将胚胎移植技术应用于无菌小鼠制备生产的新型隔离器。本研究主要研究结果如下:　　1.基于将隔离器与显微镜组合，本研究创制了一种隔离器。本研究通过参与无菌小鼠平台无菌小鼠制备、繁育、饲养等工作，充分了解常规无菌小鼠软质隔离器各组件功能。在此前提下，本研究完成了对所要创制隔离器的设计。该隔离器操作模块分为子操作模块A软质部分与子操作模块B硬质部分，操作人员通过子操作模块A软质部分对无菌假孕小鼠进行饲养与麻醉，通过子操作模块B硬质部分对无菌假孕小鼠进行胚胎移植。随后，本研究通过实地考察实验动物笼器具公司，了解笼器具生产材料。在此前提下，本研究检测了各种隔离器组件材质，并委托代工机构进行子操作模块A软质部分与操作子模块B硬质部分制作。最后通过实物组装对一些尺寸参数进行修正。　　2.基于创制隔离器，本研究首次建立利用非手术胚胎移植法制备无菌小鼠的技术操作流程。本研究前期胚胎操作在放置于超净工作台内的定制胚胎操作箱中进行,通过体外受精与胚胎体外培养技术获得了 C57BL/6小鼠的二细胞与囊胚。随后通过经宫颈胚胎移植装置吸取囊胚，并打包传入创制隔离器内。最后在子操作模块B硬质部分对麻醉后的假孕小鼠进行非手术法胚胎移植。　　3.基于各种检测手段，本研究创制的隔离器可以形成无菌环境，本研究创建的通过非手术法胚胎移植技术对无菌小鼠进行胚胎移植的方法可靠。本研究通过革兰氏染色镜检法、脑心浸液肉汤培养基培养法、液体硫乙醇酸盐培养基培养法、胰酪大豆胨液体培养基培养法、哥伦比亚血琼脂培养基培养培养法、分子生物学技术方法、寄生虫检查方法、病毒检查方法、无菌动物生理学特性分析方法，对创制隔离器内环境、无菌小鼠非手法胚胎移植过程中各种可能污染来源进行检测。　　综上所述，本研究成功创制一种适用于胚胎移植技术制备无菌基因工程小鼠模型的新型隔离器。该新型隔离器不仅可以维持长期无菌环境，而且适用于胚胎移植技术操作要求，其成功创制将突破传统隔离器发展瓶颈，引领无菌动物制备隔离器发展新方向。本研究将对无菌基因工程小鼠制备效率的提升及相关模型资源开发具有重要意义，继而大力推动人和动物基因与微生物互作共同影响人类重大疾病表型与畜禽重要生产经济性状等基础理论研究。

关键词： ε-聚赖氨酸   小白链霉菌   全细胞转化   基因工程   L-赖氨酸降解途径  

摘要： ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是一种同型氨基酸聚合物,在ε-PL合成酶（ε-PL synthetase,Pls）的催化作用下,由5-35个L-赖氨酸单体以ε-氨基和α-羧基缩合形成的酰胺键连接而成。由于其具有广谱抑菌活性和高的生物安全性,目前被批准用作天然食品防腐剂,在日本、韩国、美国和中国的食品工业获得较为广泛的应用。通过小白链霉菌（Stretomyces albulus）以葡萄糖为底物进行好氧发酵是工业生产ε-PL的主要方式。但该方法存在底物转化率低（约10%）、发酵周期长（7～8天）、需氧量大和代谢副产物多等问题,这直接导致其生产效率低和生产成本高,从而限制了其在食品工业中的广泛应用。以往的研究证实L-赖氨酸是ε-PL合成前体。同时,L-赖氨酸也是典型的大宗发酵产品,具有价格低廉、来源稳定等特点。因此,开展利用外源L-赖氨酸作为底物发酵生产ε-PL的研究具有重要研究价值。 本论文以一株ε-PL工业生产菌株*** GS114为研究对象,首先借助全细胞转化法提高了*** GS114利用胞外L-赖氨酸合成ε-PL的能力,再利用基因工程手段对*** GS114摄取胞外L-赖氨酸能力和转化形成ε-PL的能力进行了强化,最后通过生物信息学和反转录PCR初步探究了*** GS114的L-赖氨酸降解途径。取得的主要研究结果如下: （1）优化了全细胞转化L-赖氨酸合成ε-PL的方法,显著提升了摇瓶水平ε-PL产量和碳源转化率。通过全细胞转化条件和培养基的系统优化,获得了最优全细胞转化L-赖氨酸合成ε-PL体系:菌龄12 h,反应温度30℃,初始反应p H 4.0,湿菌体量为190 g·L-1,葡萄糖浓度80 g·L-1,L-赖氨酸浓度15 g·L-1,柠檬酸浓度15 g·L-1,硫酸铵浓度6 g·L-1。基于该转化体系,*** GS114在96 h合成ε-PL产量和L-赖氨酸利用量达到13.80 g·L-1和5.5 g·L-1,分别是常规摇瓶发酵的4.1倍和3.0倍。 （2）构建了组合过表达Pls和EcLysP工程菌株,显著提升了5 L发酵罐水平ε-PL产量和碳源转化率。首先,在*** GS114中过表达ε-PL合成酶（Pls）,实现过表达菌株ε-PL合成能力较出发菌提升了34.9%。其次,筛选到来自大肠杆菌的L-赖氨酸特异性渗透酶（EcLysP）并将其在*** GS114中成功异源表达,使得ε-PL产量和L-赖氨酸利用效率分别提升了25.0%和63.1%。随后,在*** GS114中组合过表达Pls和EcLysP,使得工程菌ε-PL合成能力进一步提升了43.0%,L-赖氨酸利用能力提升了1.2倍。最后,在5 L发酵罐中采用补料-分批发酵方式,实现工程菌的ε-PL产量达到88.6 g·L-1,为目前文献报道最高发酵水平。 （3）结合生物信息学和反转录PCR,初步探究了*** GS114中L-赖氨酸降解途径。首先,通过文献和数据库调研,确定了在生物体内已被发现的12条L-赖氨酸降解途径,其中细菌7条、真菌3条、动物和植物2条。其次,通过对*** GS114全基因组测序和RT-PCR实验,挖掘并验证了*** GS114中存在2条L-赖氨酸降解途径,分别为5-氨基戊酸途径和N6-羟基L-赖氨酸途径。

关键词： 艰难拟梭菌   基因工程   ACE   fliL   CD630＿RS03050  

摘要： 目的:构建艰难拟梭菌fliL基因及CD630＿RS03050基因的敲除菌株ΔfliL及ΔCD630＿RS03050,并在ΔfliL及ΔCD630＿RS03050基础上构建回补菌株::fliL及::CD630＿RS03050。通过比较野生型菌株CD630、敲除菌株(ΔfliL及ΔCD630＿RS03050)及回补菌株(fliL及::CD630＿RS03050)的生理、生化、转录、毒力等方面的差异,探究fliL基因及CD630＿RS03050基因在艰难拟梭菌生长、繁殖、毒力及致病中的生物学功能。方法:首先,以艰难拟梭菌pyr F基因为靶基因,采用同源重组方法构建pyr F敲除菌株,作为后续基因研究的底盘细胞;然后,以pyr F突变菌株为基础,利用非等长同源臂偶联等位交换(Allele-coupled exchange,ACE)方法分别构建fliL基因和CD630＿RS03050基因缺失菌株?fliL和?CD630＿RS03050,以及回补菌株::fliL和::CD630＿RS03050;再次,利用生理生化分析技术,分别分析野生菌株CD630、敲除菌株(?fliL、?CD630＿RS03050)回补菌株(::fliL、::CD630＿RS03050)的表型变化,包括:形态变化、生长速率、抗生素敏感性、p H耐受性、运动能力、产胞特性、产气能力、毒力变化等。最后,为了研究CD630＿RS03050基因突变对艰难拟梭菌转录水平的影响,我们利用高通量转录组测序技术,对野生菌株(CD630)、敲除菌株(?CD630＿RS03050)进行了转录组测序,从转录水平进一步分析CD630＿RS03050基因的功能。结果:采用同源重组技术成功构建艰难拟梭菌pyr F基因突变菌株Δpyr F,以Δpyr F作为底盘细胞采用ACE技术成功获得fliL及CD630＿RS03050基因的敲除菌株及回补菌株:?fliL、?CD630＿RS03050、::fliL及::CD630＿RS03050。艰难拟梭菌fliL基因敲除后,ΔfliL生长速率及最大生物量均小于CD630,::fliL回补菌株生长情况回复至野生型。与CD630菌株相比,ΔfliL对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,::fliL抗生素敏感性部分回复至野生型水平。另外,ΔfliL运动能力显著降低,::fliL运动能力超越野生型CD630菌株。相比CD630,ΔfliL在p H为5时耐受能力显著提高,在p H为9时,耐受能力显著降低。除此之外,fliL产胞能力较CD630显著降低,::fliL产胞能力部分恢复。艰难拟梭菌CD630＿RS03050基因敲除后,ΔCD630＿RS03050菌株的自溶率低于野生型CD630,在耐受抗生素的能力方面与CD630有明显的差异。在运动能力方面,突变菌株表现出较高的运动能力,CD630 RS03050基因回补后运动能力则更接近CD630。突变株产生的气体体积和硫化氢量明显高于CD630,通过细胞毒性实验和Western blot实验验证ΔCD630＿RS03050产生的毒素量降低。当CD630＿RS03050基因被补充后,上述表型均回复或部分回复至野生型。转录组结果进一步验证表型变化提示相较于CD630,ΔCD630＿RS03050突变菌株中246个基因表达下调同时187个基因表达上调。CD630＿RS03050基因功能障碍后,影响到细胞质膜、细胞周边结构、磷壁酸的代谢过程、脂磷壁酸的合成过程和丝氨酸的半胱氨酸生物合成过程等从而导致艰难拟梭菌在表面结构、自溶速率、运动能力、硫化氢产量及毒素释放等表型产生变化。结论:艰难拟梭菌flil基因在其生长繁殖、适应环境、运动及产孢能力均具有重要作用。CD630＿RS03050显著影响菌株自溶、环境耐受能力、运动能力、硫代谢及毒力等生理生化活动。综上,本研究中fliL基因和CD630＿RS03050基因调控的生理和生化表型对艰难拟梭菌的感染和复发及其关键,并进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病性,本研究可能为艰难拟梭菌的防治提供新的方案。

关键词： 无创产前检测技术   妇科恶性肿瘤   子宫内膜癌   卵巢癌   宫颈癌筛查  

摘要： 目的:妇科恶性肿瘤严重威胁着全球女性的生命安全,常见的妇科三大恶性肿瘤包括:子宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢癌。近年来除子宫颈癌有相对规范的筛查及预防措施外,子宫内膜癌及卵巢癌缺乏简单、便捷及无创的筛查方法。妇科恶性肿瘤病人的预后与肿瘤分期密切相关,期望够早期识别并且筛查妇科恶性肿瘤患者,提高癌症患者的生存年限及生存质量。异质性和染色体不稳定性(Chromosomal Instability;CIN)是恶性肿瘤细胞的普遍特征,会引起同一肿瘤中的不同细胞存在不同的染色体异常,包括数目异常(如非整倍体、异倍体等)和结构异常(如缺失、重复、易位等)。恶性肿瘤患者外周血游离DNA含有少量来源于肿瘤细胞的游离 DNA(cell-free circulating tumor DNA;ctDNA)。肿瘤细胞的染色体异常会引起来源于相应染色体或染色体片段的ctDNA数量异常,这些数量异常的ctDNA会导致相应染色体或染色体片段来源的外周血游离DNA的数量异常,引起多染色体非整倍体(multiple chromosomal aneuploidies,MCA)。高通量测序技术可以检测出这种外源性游离DNA数量异常引起的外周血游离DNA数量异常,并已在胎儿非整倍体的无创产前检测(Noninvasive Prenatal Testing;NIPT)中得到了广泛应用。本研究对妇科恶性患者外周血血浆游离DNA进行高通量测序,并使用基于NIPT的算法分析测序数据,研究是否能够检测到妇科妇科恶性肿瘤患者血浆游离DNA存在MCA,为今后开发一种新的无创的妇科恶性肿瘤的筛查与疗效监测的方法提供研究思路和初步实验数据。方法:选取2021年10月-2022年12月于中山市博爱院检查的100例疑似输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌等患者,收集其血液样本及手术患者的肿瘤组织病理切片样本。同时收集100例正常女性外周血作为对照。经临床、病理诊断恶性肿瘤19例,交界性肿瘤1例,分离其外周血血浆中的游离DNA并进行高通量测序,接着对测序数据按照NIPT筛查胎儿非整倍体的算法进行分析,然后对20例妇科肿瘤患者肿瘤组织DNA进行CNV-seq测序,排查NIPT技术检测的变异是否来源于肿瘤细胞,并对7例肿瘤患者血细胞进行CNV-seq测序,最后对患者生存情况进行随访。结果:20例通过临床病理确诊的妇科恶性肿瘤患者中的7例检测到MCA,总阳性率为35%。不同临床分期及病理分化程度MCA阳性率不同,临床分期为Ⅰ-Ⅱ期(早期)的病例MCA阳性率为18.8%(3/16);Ⅲ-Ⅳ期(晚期)的病例MCA阳性率为100%(4/4),病理分化程度为高中分化的病例MCA阳性率为15%(2/13),中低分化的病例MCA阳性率为50%(3/6)。7例血细胞CNV-seq检测中,2例检测出CNV变异,但其变异与NIPT检测所得变异不同。20个病例的肿瘤细胞DNA,因DNA提取浓度低,未能成功进行CNV-seq检测。结论:1、本研究通过NIPT平台对妇科妇科恶性肿瘤患者血浆游离DNA进行高通量测序检测,MCA的总阳性检出率为35%。2、在晚期恶性肿瘤患者中,MCA阳性率高,但在早期患者中MCA检出率低。3、本研究患者血细胞CNV-Seq检测未发现与高通量测序所检测的染色体异常中的相同变异。据此推测血浆游离DNA检测中发现的MCA可能来源于肿瘤细胞而非患者自身携带。4、本研究发现肿瘤患者阳性检出率与肿瘤组织分型可能无关。

关键词： 线粒体全基因组   体型大小   系统发育分析   中国大鲵   正选择  

摘要： 现生的两栖动物可分为3个类群:蚓螈目(Gymnophiona)、无尾目(Anura)和有尾目(Caudata)。与其他脊椎动物相比,两栖动物的体型整体偏小。但也有一些特例,如以大鲵为代表的隐鳃鲵科(Cryptobranchidae),其中中国大鲵(Andrias davidianus)的体长可达2 m,体重超过50 kg,属于现生体型最大的两栖动物。但有关隐鳃鲵科巨大体型的适应性进化机制尚缺乏探究。能量是一切生命活动的基础,线粒体是生命体的能量工厂,其所包含的13个蛋白编码基因通过氧化还原反应与机体的能量代谢密切相关。在有尾类线粒体基因组蛋白编码基因的进化过程中,以大鲵为代表的隐鳃鲵科是否会受到独特的选择压力并使其朝着体型增大的方向演化或与其他某些独特的性状有关?为了系统性地回答这一科学问题,本研究首先从DNA非损害性取样和线粒体基因组测序组装等两个技术层面着手研究。随后,基于线粒体基因组的13个蛋白编码基因数据,构建了有尾类的系统发育关系。最后,通过经典的进化选择分析,非同义替代率和同义替代率的比值ω(d N/d S),探讨了大鲵为代表的隐鳃鲵科在有尾类进化过程中是否受到特定的选择压力。本研究具体结果如下:(1)以人工养殖的大鲵为研究对象,比较了口腔拭子、皮肤拭子、皮肤脱落物和尾静脉采血4种取样方式对DNA质量的影响。同时,基于皮肤拭子样品,进一步比较了试剂盒法、高盐法、苯酚氯仿法和磁珠法对DNA提取效果的影响。结果表明:4种非损害性取样方法均能获取目标物种的DNA,且均未对取样对象的行为或适合度产生明显影响,但在DNA质量和浓度方面存在一定差异,其中,效果最好的是尾静脉采血法,其次是口腔拭子法和皮肤拭子法,而皮肤脱落物法的取样效果较差。而基于皮肤拭子采用4种不同的DNA提取方法所获得的DNA质量整体上差异较小。(2)以人工养殖的大鲵为研究对象,通过传统测序和高通量测序测定了其线粒体全基因组,结果表明:高通量测序比传统测序获得的线粒体基因组完整度更高,性价比也更高,是当前的优选办法。以11种动物(含4种有尾类)的高通量测序数据为材料,系统比较了原始数据量和组装结果之间的关系,同时也对比了不同组装软件的组装效果。结果表明:组装数据量与物种基因组大小之间存在一定的关系,当组装数据量为物种基因组的0.4～1倍时,组装效果最好,并且NOVOPlasty组装效果整体优于Mito Z和MEANGS。(3)对本研究组装的4种有尾类线粒体基因组(其中3种疣螈属Tylototriton物种为第一次报道)特征进行了系统研究,结果表明:宽脊疣螈和茂兰疣螈完整的线粒体基因组长度都为16265 bp,高望界疣螈为16259 bp,而大鲵为16567 bp。4种有尾类线粒体都由13个蛋白编码基因、2个核糖体RNA基因、22个转运RNA基因和一个控制区所组成。大鲵的线粒体全基因组和蛋白基因的组成均偏向于T和C,而疣螈则偏向于A和C。大鲵和疣螈的线粒体基因组在多个方面特征上都表现出不同形式的演化模式。(4)基于NCBI上已发表的153条和本研究新测序的4条有尾类线粒体基因组序列,采用ML和BI法构建了有尾目的系统发育树。结果显示:蚓螈目是单系群,有尾目和无尾目为姐妹群。有尾目分为3个分支,最先分化的是鳗螈科(Sirenidae),然后是隐鳃鲵亚目(Cryptobranchoidea)和蝾螈亚目(Salamandroidea)。隐鳃鲵亚目由隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)和小鲵科(Hynobiidae)组成。通过以隐鳃鲵亚目为研究数据集,以隐鳃鲵科为前景枝,小鲵科为背景枝,使用Easy Code ML软件进行选择压力分析,对检测出的正选择位点使用Datamonkey和Tree SAAP进行验证,并标记到相应蛋白的三维结构上。结果显示:Easy Code ML分析软件在ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、ATP6、ATP8、COⅡ和CYTB中共检测到28个正选择位点,其中有18个位点发生了氨基酸激进性改变,有25个位点至少被2种方法检测到,有5个位点同时被3种方法检测到,且大部分位于α-螺旋区域或关键结构域。这些候选基因及位点可能在隐鳃鲵科体型增长或长寿等独特性状的进化过程中发挥了重要作用。综上,本研究过程中探索的非损害性DNA取样方法和线粒体基因组测序组装方法可为其他濒危两栖动物分子生态学研究提供参考。通过基于线粒体基因组的大鲵和其他有尾类中的系统进化研究,为性状演化与线粒体进化关系提供了新的视角。

关键词： 高粱淀粉   多尺度结构   淀粉合成与代谢通路   基因工程  

摘要： 淀粉,除了作为人类主要能量来源之外,在非食品领域,如造纸、纺织、粘合剂、可生物降解塑料、制药和护肤品等应用广泛。其在各领域中的应用与理化特性直接相关,而理化特性是由淀粉来源和多尺度结构决定,因此,明确淀粉多尺度结构是实现各类型淀粉精准应用的前提。目前,针对天然淀粉在溶解性、凝胶性能和粘弹性、重结晶和消化性等方面存在的诸多不足,多采用化学、物理和生物学方法改性淀粉以赋予其新功能。生物学方法作为“绿色改性”方法之一可以在上游调控淀粉合成,以生产更多符合工业和社会需求的淀粉类型,是国内外研究人员共同关注的热点问题。高粱(Sorghum bicolor（L.）Moench)作为C4植物,因其抗盐碱、干旱、热胁迫等恶劣环境的能力强,被广泛种植于热带、亚热带和温带地区,是世界上仅次于小麦、玉米、水稻和大麦的第五大重要谷物作物。淀粉是高粱籽粒的主要成分（65%-70%）,充分深入研究高粱淀粉的结构性质对拓宽高粱、高粱淀粉及淀粉产业具有重要意义。然而,针对“从高粱淀粉的合成源头调控淀粉结构”的研究鲜有报道。在现阶段高粱种质资源的基础上,明确如何通过遗传转化的方式获取新型高粱淀粉类型对扩展淀粉应用有重要意义。本研究以不同直链淀粉含量高粱淀粉理化特性差异为基础,采用“倒序的方式”,探究不同品系不同生长阶段高粱胚乳中淀粉颗粒多尺度结构生长演变规律;通过转录组测序深入探讨调控淀粉多尺度结构合成基因的种类及功能;通过基因工程技术获取了多种类型高粱淀粉并在体外纯化获取了调控高粱淀粉合成的三种关键基因,进一步构建了淀粉合成关键基因-结构-性质的关系网络,为实现在高粱淀粉合成的源头精准调控淀粉结构提供了参考依据。主要研究内容如下:（1）不同品系不同生长阶段高粱淀粉多尺度结构与理化特性分析。结果显示发育过程中糯高粱、粘高粱和H37高粱中直链淀粉含量分布范围分别为4.80%-6.25%、5.82%-9.76%和17.87%-27.47%。中间级分在淀粉生成初期即存在,在蜡质高粱发育后期直链淀粉通过中间级分转化为支链淀粉;发育19天糯高粱支链淀粉中B1链含量最高,而粘高粱与之相反。通过分析支链淀粉内链发现,H37高粱淀粉内链聚合度高于蜡质高粱淀粉。高粱淀粉颗粒半结晶层状结构厚度介于9.4-10.7nm,且属于典型的A型结晶结构,其相对结晶度随发育时间延长增加。不同发育阶段糯、粘和H37高粱淀粉的13C CP/MAS NMR图谱均在100-106ppm（C1）处出现了三个独立峰。发育10-19天高粱淀粉颗粒大小和光滑程度不均一,但是呈现规则形状,且颗粒表面存在孔径为178-298nm的微孔。随着发育时间延长,颗粒表面因受挤压成为不规则多边形,且微孔通道深度加深。此外,淀粉的焓值和抗水解能力均随着生长期延长而增长,但是蜡质高粱淀粉颗粒的水解速率显著高于H37高粱淀粉。（2）通过转录组测序分析明确了高粱胚乳中淀粉与蔗糖合成代谢通路:Ko00500。该通路共涉及184个基因,在高粱淀粉合成过程中发挥生理功能的基因有22个,但是在糯、粘和H37高粱中与淀粉合成相关酶直接相关且具有高表达量的基因共13个。基因的功能总结为如下:（1）AGPLS1决定籽粒产量;（2）GBSSI主要负责直链淀粉合成,参与支链淀粉长B链合成;（3）SSSI是支链淀粉合成必不可少的酶,SSSIIa和SSSIIIa分别负责DP>25和12对照组>敲除样本。转基因受体Wheatland高粱淀粉中直链淀粉含量为25.6%,GBSSⅠ敲除高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量为1.1%-3.5%;GBSSⅠ过表达高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量为33.3%-45.1%。GBSSⅠ基因敲除直接减少了B1链合成,而GBSSⅠ基因过表达淀粉中B2+B3链含量显著增加。转基因淀粉的糊化温度和糊化黏度顺序为:GBSSⅠ-敲除<对照对照>GBSSⅠ-过表达。因此,GBSSⅠ基因的主要功能是合成直链淀粉和延长支链淀粉的A链至B1链。（4）通过转基因手段获取了分别含有SSSⅡa、SBEⅡb和GBSSⅠ的基因工程菌p ET-28a（+）。经过诱导纯化获取了具有活性的上述三种酶。将上述三种酶应用于淀粉改性,淀粉的链长分布、结晶结构、热力学以及消化性均发生了显著变化,判断出上述三种酶的主要功能:SBEⅡb水解不同聚合度长侧链形成短侧链A;SSSⅡa以ADPG为底物延长不同聚合度B链链长,以B1链为主;GBSSⅠ以ADPG为底物延长A链形成B1链。（5）根据上述内容中调控高粱淀粉合成的基因种类/功能、淀粉多尺度结构及理化特性之间的关系,构建了定向调控高粱淀粉结构性质的关系网络,以期实现生物学方法获取新型高粱淀粉。