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关键词： 基因工程操作技术   在线开放课程   混合式教学   教学改革  

摘要： 基因工程操作技术是农业生物技术、遗传育种等农林类相关专业的必修课，是基因工程操作相关实验员、检测员等岗位的核心课程。在新农科建设大背景下，本研究在分析课程现状和高职学生学情的基础上，组建教学团队，明确教学目标，根据课程设计理念梳理教学内容，开发在线开放课程，探索线上线下任务驱动式混合教学模式，对加快新农科建设、推进高等农林教育教学改革、服务广东的地方经济建设等具有十分重要的现实意义。

关键词： 基因工程   课程思政   教学效果   探索与实践  

摘要： 课程思政是高校落实立德树人根本任务的重要举措。结合“课程思政”理念和格局，在基因工程课程中系统挖掘课程思政元素，探索基因工程课程实现课程思政目标的有效教学方法。通过课程思政教学方案的设计；思政元素的发掘；寻求课程实现教书育人的路径；思政案例的展示及教学反思五方面的探索，旨在通过专业课程思政助力提升专业知识育人的目的，建立传播知识、培养能力、价值引领的有效途径。

关键词： 研究型实验   高中生物   基因工程   生物教学  

摘要： 高中生物教学之中，实验教学是其重要的组成部分，尤其是研究型实验的开展，对提升学生实践能力与创新能力具有重要意义。因此，教师在开展生物课堂教学活动时，要根据学校发展实际，结合学生认知发展特点，有针对性地开展综合性与连贯性较强的研究型实验项目，全面提升课堂教学质量。当前，我们正处于互联网信息技术快速发展的时代，通过将互联网引入课堂教学，不仅可以有效缓解课堂教学时长不足的问题，使得学生可以全方位地感受实验过程，还有助于全面培养学生生物核心素养，有效提升生物教学质量。基于此，文章以基因工程实验为例，探究高中生物教学中研究型实验的实践效果及完善。

关键词： 非洲猪瘟病毒   分子内佐剂   重组蛋白   抗原免疫效果  

摘要： 非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）可感染所有品种和年龄的猪，死亡率达100%，疫苗是有效的防控策略且目前尚无有效疫苗，因此国内外各界对非洲猪瘟疫苗的需求愈发迫切，我国政府更是出台多项政策，重点推进非洲猪瘟疫苗研制。亚单位疫苗由于其安全性高而成为研究热点，但其免疫原性较弱，佐剂可以增强抗原诱导的体液和细胞免疫反应，其中分子内佐剂能够显著提升抗原诱导的免疫应答，因此利用分子内佐剂提升ASFV亚单位候选疫苗免疫效果的研究具有重要意义。　　本课题旨在探究分子内佐剂促吞噬肽tuftsin单独作用及联合破伤风毒素肽TT-P2作用ASFV重组蛋白p753对抗原诱导产生的体液和细胞免疫效果的影响。利用生物信息学软件分析并设计ASFV重组蛋白p753、p753-Tuftsin和p753-Tuftsin-TT序列。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白;通过DEAESepharoseFastFlow和Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白;透析法复性重组蛋白并用TritonX-114液相萃取法去除内毒素;采用westernblotting和Dot-ELISA试验鉴定抗原性。在小鼠模型上筛选p753的适配佐剂和免疫剂量。不同抗原的免疫效果通过免疫小鼠产生的特异性IgG和IgG1/IgG2a型抗体水平、淋巴细胞增殖情况、细胞因子IL-2、IL4和IFN-γ含量及T淋巴细胞亚群分化情况综合分析，抗原的安全性采用组织病理检查法进行评价。　　确定p753、p753-Tuftsin和p753-Tuftsin-TT的序列分别为p72（217-414aa）-p54（5-29aa）-p30（137-174aa）、p753-Tuftsin（289-292aa）和p753-Tuftsin-TT（830-843aa）。三种重组蛋白均以包涵体形式表达，均在37℃、0.5mmol/LIPTG条件下诱导表达4h时表达量最高;均达到90%以上纯度和80%以上复性回收率，且内毒素残留量均不高于50EU/mL;westernblot和Dot-ELISA结果显示三种蛋白均具有抗原性。通过小鼠模型确定的免疫佐剂和剂量为ISA61VG和60μg;检测的p753、p753-Tuftsin和p753-Tuftsin-TT抗体效价分别为1∶64000、1∶128000和1∶204800;p753-Tuftsin组和p753-Tuftsin-TT组平台期IgG1和IgG2a抗体水平、抗原刺激指数、脾脏淋巴细胞细胞因子IL-2、IL4、IFN-γ含量及CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞相对百分比均显著高于p753组，且p753-Tuftsin-TT组最高。　　制备出三种纯度高、符合内毒素残留标准且能与高免血清反应的重组蛋白;三种抗原经免疫效果评价显示分子内佐剂tuftsin对p753诱导产生的免疫应答有提升作用，且TT联合tuftsin的提升作用更佳，p753-Tuftsin-TT具有成为候选疫苗的潜力。本研究为ASFV亚单位疫苗及其他亚单位疫苗的开发提供一种新思路。

关键词： 小麦   HMW-GS   半胱氨酸   染色体易位   碱基编辑  

摘要： 小麦籽粒中高分子量谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunit,HMW-GS)的组成和结构对面粉加工品质具有重要影响,改良HMW-GS的组成和结构有望加快优质小麦新品种培育。本论文首先通过回交转育的方法将携带优质麦谷蛋白亚基编码基因的小麦-高大山羊草易位染色体1SL·1BS和1BL·1SS转入推广品种中,培育出农艺性状优良的新易位系;第二,利用转基因技术将高大山羊草潜在优质HMW-GS编码基因1Sx2.3~*、1Sy16~*和1Sx2.3~*-1Sy16~*转入小麦,创制无筛选标记转基因株系;第三,利用单碱基编辑技术编辑小麦HMW-GS基因,创制编码半胱氨酸密码子增加的新材料;最后,对易位系和转基因材料进行转录组测序和面包加工品质等分析。研究HMW-GS组成及结构变化对小麦加工品质的影响,探讨品质改良的分子机制,主要结果如下:1、通过回交和分子标记辅助选择等方法将小麦-高大山羊草易位染色体1SL·1BS和1BL·1SS分别转育到农艺性状优良的宁春4号、宁春50号和Westonia小麦品种中,获得每个遗传背景1SL·1BS新易位系2个,1BL·1SS易位系3个。易位系原位杂交鉴定显示均存在1对易位染色体。易位系40K液相芯片结果显示易位系与轮回亲本相似度91.18～96.37%。1BL·1SS易位系液相色谱分析显示谷蛋白含量显著增加。1BL·1SS和1SL·1BS易位系面包品质均提高。2、利用农杆菌介导法将高大山羊草中HMW-GS编码基因1Sx2.3~*和1Sy16~*以单一或连锁的方式转化到不同小麦品种,通过分子标记和SDS-PAGE等检测获得以Fielder为受体的3个转1Sx2.3~*-1Sy16~*无筛选标记纯合株系,2个转1Sx2.3~*纯合株系,1个转1Sy16~*无筛选标记纯合株系,2个转1Sy16~*纯合株系;以CB037为受体的1个转1Sx2.3~*-1Sy16~*无筛选标记纯合株系,以Westonia为受体的2个转1Sx2.3~*-1Sy16~*纯合株系。转1Sx2.3~*株系、转1Sy16~*株系和转1Sx2.3~*-1Sy16~*株系的面包加工品质均改良。3、从小麦-高大山羊草1SL·1BS和1BL·1SS新易位系和轮回亲本,以及转基因株系和受体的叶片及花后20 d籽粒中提取RNA进行转录组测序,结果显示,与轮回亲本相比易位系叶片和籽粒中都有更多的差异表达基因;与转基因受体相比转1Sx2.3~*-1Sy16~*和1Sy16~*株系的籽粒中有较多的差异表达基因。易位系中的差异表达基因主要集中在发生易位的1B染色体上,转基因株系中的差异基因均匀分布在各条染色体上。转1Sy16~*株系中醇溶蛋白基因表达量显著增加,转1Sx2.3~*株系中部分增加,转1Sx2.3~*-1Sy16~*株系中介于上述2类转基因株系之间。4、利用农杆菌介导法将构建的腺嘌呤碱基编辑器ABE8e-NGG和ABE8e-NG转入小麦品种Fielder中,并对HMW-GS编码基因1Bx14和1Dx2进行编辑,ABE8e-NGG类型的2个靶点1Bx14-g223和1Dx2-g232获得编辑植株,编辑效率分别为85.00%和52.94%,编辑类型为1Bx14-Y70C纯合和杂合类型、1Dx2-Q72R-Y73C杂合类型,编辑位点在远离PAM端第3位和第6位。分离后代筛选获得1Bx14-Y70C、1Dx2-Y73C和1Dx2-Q72R-Y73C类型无筛选标记纯合编辑株系。1Bx14-Y70C、1Dx2-Y73C和1Dx2-Q72R-Y73C纯合编辑株系中的1Bx14或1Dx2均增加1个半胱氨酸,3种纯合株系的面粉SDS沉降值均增大,1Bx14和1Dx2突变体显著增大。

关键词： 丹参   MYB转录因子   丹参酮   基因工程   毛状根培养  

摘要： 丹参(Salvia mitiorrhiza Bunge.),唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia)的多年生草本植物,多用于治疗心脑血管等疾病。天然丹参酮含量较低,且化学合成方法复杂易造成环境污染,目前通过基因工程手段增加丹参酮含量已成为研究热点。本研究以实验室前期筛选得到的丹参SmMYB1转录因子为研究对象,基于转基因技术和发根农杆菌介导的遗传转化,成功构建了一套导入外源SmMYB1基因的毛状根诱导培养体系,获得了过表达SmMYB1转基因毛状根,并对其生物量、相关基因表达量以及丹参酮含量进行检测分析,初步探究了SmMYB1对丹参酮类物质生物合成和积累的影响。主要研究结果如下:1.从丹参中克隆得到SmMYB1全长基因编码序列,共1071bp,编码356个氨基酸。2.将SmMYB1与拟南芥等其它物种中保守程度较高的20条MYBs转录因子序列在氨基酸水平上进行比对,发现SmMYB1与紫苏(Perilla frutescens)中的Pf MYB1-like亲缘关系较近。3.对丹参SmMYB1基因进行表达特征分析,组织表达模式分析结果显示丹参SmMYB1基因在各个组织中的表达具有显著差异,其中叶中最高,根中次之,茎和花中最低。诱导表达模式分析结果显示外源Me JA和SA处理显著促进丹参根部组织SmMYB1基因的表达,均在24 h处达到高点,分别为对照的1.32倍和2.86倍,其中与Me JA诱导后相比,受SA诱导后SmMYB1响应较为显著。亚细胞定位显示SmMYB1基因的绿色荧光出现在细胞核中。4.通过发根农杆菌***介导的丹参叶盘法遗传转化共获得11个SmMYB1过表达阳性毛状根,转化效率为36.7%。经液体扩大培养后,获得SmMYB1-OE3、SmMYB1-OE5、SmMYB1-OE8、SmMYB1-OE16和SmMYB1-OE20共5个过表达株系,经检测发现过表达SmMYB1显著增加了丹参毛状根的生物量,其中SmMYB1-OE16株系干重最高为对照的2.46倍。5.利用q RT-PCR方法检测SmMYB1过表达毛状根株系中的丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达水平,结果显示过表达SmMYB1能够显著上调SmDXS、SmGGPPS、SmKSL1、SmCYP76AK1和SmCYP71D375的表达水平。6.利用UPLC方法检测SmMYB1过表达毛状根中的隐丹参酮和丹参酮ⅡA含量,结果显示SmMYB1过表达株系中隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量显著上升,其中SmMYB1-OE16株系中隐丹参酮含量最高为0.75 mg/g,SmMYB1-OE8和SmMYB1-OE20株系中的丹参酮ⅡA的含量上升最为明显,分别为0.59 mg/g和0.58 mg/g。综上所述,本研究克隆得到丹参中的SmMYB1转录因子,并利用基因工程手段和成熟的丹参毛状根培养体系获得了转基因毛状根材料,通过研究发现SmMYB1作为重要反馈调节因子影响丹参酮类物质的生物合成,促进了丹参毛状根的生长及毛状根中丹参酮类物质的积累。

关键词： 胚胎干细胞   分化   胸腺类器官   功能性T细胞   单细胞转录组   第三咽囊内胚层   胸腺   HOXA3   EPHB2   Wnt  

摘要： 胸腺是人体免疫的重要器官。当胸腺发生病变时,机体免疫功能受损,免疫功能紊乱并伴发自身免疫性疾病。近年来,干细胞培养技术日益成熟,类器官的产生也为其注入新的力量。胸腺类器官在组织再生和疾病生物学模型方面具有较大潜力,其可能替代天然胸腺组织。然而,目前现有技术仍未构建出从单一细胞源的人胚胎干细胞(hESCs)或人诱导多能干细胞(hiPSCs)分化发育而来的胸腺类器官。因此,能否从单一细胞定向分化为多细胞组成且具有完整胸腺器官功能的胸腺类器官是本课题研究的主要目标。针对这一难题,本论文依据hESCs具有自我更新和多向分化的特性,建立了一种hESCs来源的人胸腺类器官(hETO)3D分化体系,并验证了其在体外和体内的多种功能。本论文主要研究内容和结果包括如下三个部分: 1.首先建立一种基于hESCs分化为中内胚层,再分化为第三咽囊,进而生成hETO的3D培养体系。通过对中内胚层、第三咽囊和hETO的关键性功能基因、蛋白以及空间结构进行鉴定,发现hETO中存在着天然胸腺器官的多种关键的细胞亚群、解剖结构和功能性标志物。小分子化合物CHIR99021、Y-27632、SB-431542以及细胞因子Activin A、DLL4、SCF、FLT3L、TPO的搭配使用能够将hESCs在3D悬浮培养条件下诱导分化为hETO。对hETO分化过程的中内胚层、第三咽囊和hETO三个阶段特异性基因和蛋白进行检测,特别是对调控T细胞发育和成熟过程中阳性选择和阴性选择的关键基因进行鉴定,并且在转录组水平分析与探究胸腺发育各阶段的基因动态变化、生物学过程以及信号转导。利用单细胞转录组测序技术将hETO与不同时期的人类天然胸腺进行比对,发现hETO的发育转录谱类似于天然胸腺的整个发育轨迹。将hETO的单细胞转录组与胎儿以及成人胸腺进行比较,发现具有多种细胞类型的hETO在亚群结构上更接近于人类19周胎儿胸腺。最后,通过细胞通讯分析预测FGF,BMP,TGFβ等信号通路在胸腺基质细胞维持胸腺上皮细胞发育和稳态中可能发挥重要的调控作用。 2.为了验证hETO的体内外功能,将人脐血来源的造血干/祖细胞(HSPCs)和hETO体外共培养或共移植免疫缺陷小鼠。在体外,hETO不仅促进HSPCs向成熟CD3+TCRαβ+T细胞分化,而且增强成熟CD4单阳(SP)T细胞和CD8 SPT细胞的阳性选择,甚至促进γδT和Treg细胞的产生。将hESCs衍生的hETO与人HSPCs共同移植到免疫缺陷小鼠后,发现hETO一方面支持人T细胞的长期发育以产生具有与天然T细胞相似的TCR多样性的成熟CD3+TCRαβ+CD4+单阳性(SP)T谱系和CD3+TCRαβ+CD8+SP T谱系,甚至产生人源γδT和Treg细胞,另一方面在体内可长期生存并形成血管且具有造血细胞归巢能力。除此之外,共移植了 hETO和人HSPCs的小鼠不仅能够通过成熟的人源辅助T细胞帮助人源B细胞来触发体液免疫以提高OVA抗原刺激而产生的特异性人IgG和IgM的分泌,并且通过成熟的人源CD8 SP T细胞介导的细胞免疫对同种异体皮肤移植物产生排斥反应。更重要的是,hESCs来源的hETO和同种异体来源的人脐血HSPCs共移植小鼠,移植HSPCs 11个月后(至今为止)小鼠未发生cGVHD,即异体来源的人免疫细胞既没有排斥hESCs来源的hETO,也没有排斥小鼠的器官组织,这表明异体来源的人源T细胞在小鼠体内经hETO发生了阴性选择。因此,hETO可以在功能上诱导T细胞的发育,取代天然胸腺构建人源化动物并制备大规模临床级的不同亚型T细胞。 3.第三咽囊(3PP)在hETO分化过程中起到承前启后的关键作用,因此,我们进一步探讨了优化3PP的分化方法及其调控机制。为此我们建立了一种在特定条件下从hESCs分化产生高纯度3PPE的方法,分化的3PPE可以有效地进一步成为功能性胸腺上皮细胞(TECs),包括具有促进T细胞成熟能力的皮质胸腺上皮细胞(cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(mTECs)。经过对第三咽囊内胚层细胞的进一步诱导分化,其不仅表达cTECs标记物K8、CD205和mTECs标记物K5、AIRE,而且能够促进T细胞成熟。随后我们探讨了在3PP形成过程中关键的转录因子HOXA3的作用,结果发现HOXA3表达促进了第三咽囊内胚层的分化和增殖,而HOXA3表达抑制则促进了第三咽囊内胚层迁移。进一步研究发现,HOXA3通过靶向EPHB2调节Wnt信号通路以控制第三咽囊内胚层的命运和功能。因此,我们的研究结果表明,HOXA3作为“开关”通过EPHB2介导的Wnt途径调节hESCs衍生的3PPE发育,我们的发现将为研究第三咽囊和胸腺器官的发育提供新的见解。 总而言之,hETO的成功构建为研究胸腺的发育规律,多样性形成的分子调

关键词： 胚胎干细胞   长链非编码RNA   多能性   增殖能力   神经细胞分化  

摘要： 背景及目的:课题组前期研究发现16号染色体上的基因间长链非编码RNA(linc-iNSC)在神经干细胞(NSCs)/诱导神经干细胞(i NSCs)上的表达量是胚胎干细胞(ESCs)/诱导多能干细胞(i PSCs)的1100倍。鉴于NSCs/i NSCs与ESCs/i PSCs都具有多能性,但后者致瘤性强,猜测linc-iNSC可能与神经分化和增生致瘤有关。本研究首先在体外探究linc-iNSC对小鼠胚胎干细胞(mESCs)的增殖、多能性和神经细胞分化的影响,然后将linc-iNSC过表达的mESCs移植到小鼠大脑皮层,在体内验证linc-iNSC对mESCs增殖、致瘤性和神经细胞分化的影响。方法:1)用linc-iNSC过表达的慢病毒(OE组)和空载对照慢病毒(CTRL组)构建mESCs细胞系,并用荧光定量PCR(QPCR)验证基因成功过表达;2)用多能性相关基因Nanog、Oct4、Sox2抗体染色检测细胞多能性,并用QPCR检测其RNA表达水平;3)用CCK-8和Ki-67抗体染色检测细胞增殖能力,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;4)用流式细胞仪检测细胞周期;5)用神经细胞标记物Neu N、Olig2、GFAP抗体检测神经细胞分化能力,并用QPCR检测其RNA表达水平;6)将体外实验获得的两组细胞系定位注射到C57BL/6小鼠的大脑皮层,在细胞移植后14天比较移植细胞生成肿瘤的克重并做HE染色明确该肿瘤的性质,在细胞移植后28天用Neu N、Olig2、GFAP抗体检测神经细胞分化情况,并用蛋白质印迹法(WB)检测其蛋白表达水平。结果:1)linc-iNSC稳定过表达的mESCs细胞系构建成功;2)OE组比CTRL组细胞增殖慢,且Ki-67染色荧光表达也更弱;同时OE组较CTRL组凋亡率高,尤其是早期凋亡细胞明显更多;3)OE组G1期延长,G2/M期缩短;4)Nanog、Oct4、Sox2抗体染色显示OE组荧光强度弱于CTRL组,与QPCR结果一致;5)Neu N、Olig2、GFAP抗体染色显示OE组比CTRL组荧光表达更强,与QPCR结果一致;6)细胞移植后14天HE染色显示两组细胞均可形成恶性肿瘤,但OE组肿瘤比CTRL组小;7)在细胞移植后28天Neu N、Olig2、GFAP抗体染色显示OE组比CTRL组荧光表达更强,蛋白表达量更高。结论:1)linc-iNSC可降低mESCs的多能性;2)linc-iNSC可抑制mESCs的增殖能力;3)linc-iNSC可促进mESCs凋亡;4)linc-iNSC可促进mESCs向神经细胞分化。