关键词：
单倍体
胚胎干细胞
家兔
印记基因疾病
摘要：
背景单倍体胚胎干细胞(haploid embryonic stem cells,haESCs)是一类来自于孤雌或孤雄发育囊胚内细胞团的胚胎干细胞,主要有三个特性,即:(1)只含有一套单一亲本的染色体;(2)能在体外无限增殖;(3)在体外长期培养过程中能保持多向分化的潜能。单倍体胚胎干细胞的研究可以追溯到二十世纪八十年代,人们发现小鼠成熟卵母细胞经孤雌激活后能在体外发育到囊胚,但用这些囊胚建立的胚胎干细胞系均是二倍体。直到2009年,来自新加坡的研究团队利用青鳉鱼孤雌发育的囊胚首次分离得到了稳定的haESCs,为其他脊椎动物尤其是哺乳动物haESCs的研究奠定了基础。除青鳉鱼外,研究人员又陆续建立了小鼠、大鼠、猴和人的haESCs。小鼠和大鼠作为常用的模式动物,在生命科学研究中占有重要的地位。但是小鼠和大鼠的生理结构和生活习性与人类相差较大,用于人类疾病相关研究时,不能很好地模拟疾病的具体发展过程;大型动物如猪、猴等虽然于人类更接近,但由于饲养成本高,因此很难用于大规模疾病模型的构建。兔作为重要的实验动物,其生殖周期短、饲养成本低,且在体型、寿命、生理功能等方面与人类较为相近,是构建人类疾病模型,尤其是大规模构建印记基因疾病模型理想的实验动物。印记基因疾病常由亲本特异等位基因表达异常引起,现有手段构建相关疾病模型,在得到纯合基因修饰的个体后还需经过复杂的交配策略,才能将特定的基因修饰固定到特定亲本的等位基因上,从而得到印记基因疾病模型,该过程往往需要耗费大量人力物力。haESCs只含有一套单个亲本来源的染色体,通过基因修饰并结合半克隆技术,就能一步获得印记基因亲本特异修饰的动物模型,大大缩短了印记基因疾病模型构建的周期。目的本研究旨在通过培养体系的优化及流式细胞分选技术以获得体外长期稳定培养的兔胚胎干细胞,扩充现有haESCs家族的成员,并结合haESCs和家兔各自独有的优势,为印记基因疾病模型快速、大规模的构建提供全新可靠的技术路径。方法1.为了获得体外长期稳定培养的兔胚胎干细胞,我们对现有培养体系进行优化。通过对调控多能性信号通路的小分子进行组合,最终成功筛选到一种培养体系,该培养体系以血清和KOSR为基础,添加一定浓度的FGF2、GSK-3抑制剂、Wnt通路抑制剂和ROCK通路抑制剂,实现了兔胚胎干细胞的体外稳定培养。2.我们通过电刺激和化学刺激联合的方式对兔卵母细胞进行体外孤雌激活,将激活后的卵母细胞转移到胚胎培养液中继续培养,约96小时后即可发育到囊胚。将体外孤雌发育的囊胚接种至饲养层细胞上,使用优化后的兔胚胎干细胞培养体系进行培养。经过4-7天后,在囊胚周围会生长出表层隆起、结构致密的outgrowth克隆,并结合流式分选技术去维持其单倍性。3.我们通过核型分析实验验证建立的兔haESCs在体外培养数代之后核型是否正常。4.我们通过对该细胞系进行AP染色、免疫荧光染色、EB和畸胎瘤形成等多能性相关实验及转录组测序,验证它的多能性。结果1.我们发现该细胞在适宜密度的feeder下培养时,具有较高的核质比,形成的克隆扁平且致密,边界清晰,符合传统胚胎干细胞的基本形态特征。除此之外,我们也发现,将其传代至0.2%明胶包被的培养皿培养时,该细胞可在体外连续传代超过40代,且能够保持良好的生长状态。2.我们通过核型分析实验验证建立的兔haESCs核型是否正常,结果显示,该haESCs均含有22条染色体,为正常兔二倍体ESCs染色体数目的一半,证明该细胞系在体外长期培养仍能维持核型稳定。3.我们从多个角度分析了该细胞系的多能性。AP染色结果显示,兔haESCs具有较强的AP活性。免疫荧光染色实验结果表明,该细胞系的多能性相关基因均具有较高水平的表达。此外,我们采用分化培养液对兔haESCs进行悬浮培养,检测其是否具有形成拟胚体的能力,同时利用畸胎瘤形成实验研究兔haESCs在体内分化的能力。实验结果显示,我们构建的这株兔haESCs能在体外形成EB,而且在体内形成的畸胎瘤含有三个胚层来源的终末分化的细胞,说明该细胞系具有多能性。4.通过RNA-Seq并对数据进行分析后,我们发现该细胞系接近于兔E6.5的epiblast,表明该细胞系很可能处于primed状态。5.我们将兔单倍体胚胎干细胞和精子共注射至去核卵母细胞,96 h后可在体外发育至囊胚阶段,说明该细胞系可以支持兔卵母细胞在体外发育至囊胚阶段。意义haESCs是一类特殊的胚胎干细胞,除具有普通胚胎干细胞相关的特性,还可在体外稳定维持单倍性,是重要的细胞资源。现有研究表明,haESCs不仅可用于高通量遗传学筛选、转基因动物的制备、染色体工程等研究外,还可用于基因组印记相关的研究。本研究建立的兔haESCs,不仅扩充了现有haESCs家族的成员,还为印记基因相关疾病模型的构建提
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