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关键词： 虹鳟鱼传染性造血器官坏死病   免疫   攻毒   注射   浸泡  

摘要： 虹鳟鱼传染性造血器官坏死病(IHN)是一种死亡率高、危害性极大的鲑科鱼类病毒性传染病。于2009年侵入甘肃省,对甘肃省虹鳟鱼产业造成毁灭性打击,使永登、永昌等地虹鳟鱼养殖场被迫停产。本试验使用兰州市威特森生物科技有限公司和兰州市渔业技术推广中心联合研制的一种IHN基因工程疫苗开展虹鳟鱼注射免疫和浸泡免疫试验,同时将免疫完成后的苗种投放到疫区开展攻毒试验。结果表明,虹鳟鱼传染性造血器官坏死病疫苗接种,采用浸泡接种的方法较注射接种更适合在生产实践中推广应用;且适宜采用二次浸泡接种的方法,第一次浸泡免疫的苗种规格为4g,第二次浸泡免疫的苗种规格为10g;该基因工程苗采用1‰浓度进行免疫效果最佳,免疫虹鳟鱼苗种成活率可达80%以上。

关键词： 胚胎干细胞   间充质干细胞   造血干细胞   诱导多能干细胞  

摘要： 干细胞是一类能自我更新并多方向分化的细胞。按照发育阶段来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞,按照分化潜能大小可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞等。本文概述了一些重要干细胞类型的概念、特点及应用。

关键词： 序列相似度60家族成员A   胚胎干细胞   肿瘤   SIN3转录调控蛋白家族成员A/组蛋白去乙酰化酶复合体  

摘要： 序列相似度60家族成员A (FAM60A)作为新型生物标志物受到广泛关注,本研究介绍了FAM60A在胚胎干细胞(ESCs)中作为SIN3转录调控蛋白家族成员A (SIN3A)复合体稳定性和功能完整性的关键蛋白,通过对细胞周期的调控,促进增殖并维持ESCs处于未分化状态。分析了FAM60A在肿瘤发生发展中的重要作用,通过调控细胞周期和各种信号通路参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学过程,提出肿瘤发生与胚胎发育有关,但具体分子机制以及参与的相关信号通路有待深层次挖掘,为以后的研究提供新方向。

关键词： 木质素降解酶   产朊假丝酵母菌   工程菌   生物学特性  

摘要： 木质素是农作物秸秆饲用化利用的主要限制因素,现仅有少数微生物产生木质素降解酶,且产量少、酶活低,不适合工业化生产,酶蛋白的高效异源表达是提高木质素降解酶产量的有效途径。工程菌ZHMX4和ZHQX1是分别从黄孢原毛平革菌和云芝栓孔菌中扩增出木质素过氧化物酶基因(lip)和漆酶基因(lac),利用同源整合重组技术构建所得的工程菌。对前期构建的表达木质素降解酶工程菌ZHMX4和ZHQX1进行了部分生物学特性研究,包括木质素降解酶适宜反应条件、木质素降解酶基因拷贝数和工程菌降解天然木质素能力的测定及工程菌营养需要分析,了解2株工程菌特性的同时为后续研究工作奠定基础。结果显示:工程菌ZHMX4和ZHQX1产木质素降解酶最适反应温度和pH分别为30℃、3.0和30℃、4.5;2株工程菌各2 mL(添加量为109 cfu/g)混合对100 g玉米秸秆进行发酵时,木质素的降解率达到50.12%;根据Biolog YT微孔板试验结果,可优化2株工程菌的培养基,在培养基中添加一些营养物质,可促进工程菌的生长。

关键词： 羧基化聚吡咯   氯化血红素   点触发链置换反应   模拟酶   转基因   电化学基因传感器  

摘要： 为适应快速增长的转基因生物(GMOs)安全评价与管理的需求,高效、可靠的转基因检测技术研究与应用的重要性日益凸显。该文采用一步法合成了羧基化聚吡咯(cPPy)与氯化血红素(Hemin)的纳米复合物(cPPy-hemin),并以其为信号标签合成了一种DNA双链结构功能化的纳米信标(DNA-cPPy-hemin)。利用cPPy-hemin增强的模拟酶催化活性,结合点触发链置换反应(TSDR)信号放大策略,制备了一种新型电化学基因传感器用于转基因成分的灵敏检测。通过信号探针(Ps)与模板链(Ts)、辅助链(As)结合形成DNA双链体结构中的-NH2功能化cPPy-hemin,制备Ts/As/Ps-cPPy-hemin双链DNA结构的纳米信标。在目标花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)序列和燃料链(Fs)存在下,TSDR过程释放出的Ps-cPPy-hemin与固定在电化学沉积金纳米粒子修饰GCE表面上巯基化的DNA捕获探针(Cs)相结合,利用cPPy-hemin对H2O2的模拟酶催化产生的电信号,可实现对CaMV35S的定量检测。在最优条件下,该传感器对目标基因序列的检测范围为1.0×10^(-14)~1.0×10^(-9)mol/L,检出限(S/N=3)为3.2×10^(-15) mol/L。制备的传感器具有良好的选择性、重现性与稳定性,可用于转基因大豆中总DNA提取物的CaMV35S转基因片段的检测。

关键词： 病原微生物   减毒   生物医药   基因工程   代谢产物   疫苗   路径思考  

摘要： 疫苗是生物医药的重要品种,是将病原微生物(如细菌、病毒等)及其代谢产物经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗产业科技创新具有高风险、高投入、高周期、高准入、高毛利等“五高”特点。

关键词： 胚胎干细胞   干细胞   因子   巨噬细胞迁移抑制因子   细胞增殖   增殖  

摘要： 背景:胚胎干细胞由于其自我更新和多向分化特性在帮助理解细胞发育以及再生医学、组织工程和细胞治疗方面潜力巨大,为能更加深入理解和有效运用人胚胎干细胞,探索发现影响人胚胎干细胞增殖存活的潜在分子是十分必要的。巨噬细胞迁移抑制因子在人类多种细胞中表达,起初认为主要参与炎症发生,但后来发现它在细胞增殖、分化、血管生成和肿瘤发生中发挥重要作用,但是人胚胎干细胞是否表达这种重要因子以及其在人胚胎干细胞中的功能仍不清楚。目的:明确人胚胎干细胞是否表达巨噬细胞迁移抑制因子及其相关受体,确定何种受体与巨噬细胞迁移抑制因子相互作用,初步探索巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞增殖存活的影响。方法:培养人胚胎干细胞,酶联免疫吸附实验检测细胞培养液中巨噬细胞迁移抑制因子水平,免疫荧光共聚焦显微镜观察巨噬细胞迁移抑制因子在细胞中的分布定位情况,细胞免疫荧光、免疫印迹方法检测胚胎干细胞中相关因子的表达;免疫荧光共聚焦显微镜、免疫共沉淀检测巨噬细胞迁移抑制因子与其受体的结合情况。分组干预:分别以巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1(0,12,24,48,96,192μmol/L)干预处理人胚胎干细胞24 h,确定最佳抑制浓度,然后将不同质量浓度巨噬细胞迁移抑制因子(30,100,300μg/L)与最佳抑制浓度ISO-1共孵育24 h。CCK-8法检测细胞增殖活性,TUNEL染色法检测细胞凋亡水平。结果与结论:①巨噬细胞迁移抑制因子在人胚胎干细胞的胞质、胞膜、培养基中均有表达;②人胚胎干细胞表达巨噬细胞迁移抑制因子,主要表达其受体CXCR2和CXCR7;③巨噬细胞迁移抑制因子主要结合受体CXCR7;④巨噬细胞迁移抑制因子抑制剂ISO-1对细胞增殖存活的影响:与空白组相比,随着ISO-1浓度增大,细胞间隙明显增大,细胞活力逐渐降低(P<0.0001),TUNEL法检测细胞凋亡率明显增加(P<0.0001);⑤加入不同质量浓度的巨噬细胞迁移抑制因子(30,100,300μg/L)后,能减弱ISO-1(192μmol/L)诱导的细胞负相作用,细胞活性显著提高(P<0.05),细胞凋亡率明显降低(P<0.01);⑥结果表明,人胚胎干细胞表达分泌巨噬细胞迁移抑制因子这一重要因子,在胞质、胞膜、细胞外均可以检测到,人胚胎干细胞主要表达巨噬细胞迁移抑制因子的受体CXCR2和CXCR7,而不是经典受体CD74,在人胚胎干细胞上与巨噬细胞迁移抑制因子互作的蛋白受体是CXCR7,没有发现与CXCR2相互作用的证据,其作用还需进一步研究。另外,研究发现巨噬细胞迁移抑制因子对维持人胚胎干细胞的增殖存活发挥重要作用。

关键词： 软骨修复   中胚层发育   胚胎干细胞   多能性维持   命运决定  

摘要： 研究背景 软骨细胞主要来源于胚胎发育早期的轴旁中胚层。在受到发育信号诱导后,轴旁中胚层形成体节。随后,体节分为腹侧生骨节和背侧皮节,前者形成包括软骨和脊柱在内的轴向骨骼,后者发育为骨骼肌和背部真皮。在小鼠胚胎发育的第12.5天,一群Col2a1阳性的间充质细胞群体由生骨节细胞分化而来,这些细胞具备形成软骨的潜力。在复杂的时间和空间调控信号通路的指导下,间充质细胞可进一步向软骨细胞分化、增殖和成熟。位于关节表面的软骨细胞产生永久性的关节软骨。 关节软骨由少量软骨细胞和大量细胞外基质(II型胶原和蛋白多糖等)组成,具备传导、吸收和缓冲震荡的能力。这些功能对于肌肉骨骼系统和机体运动功能的发挥至关重要。然而,由于关节软骨缺乏血管和神经的支持,它在遭受遗传、外伤、炎症和衰老等多种因素影响导致损伤时,自身修复能力非常有限。受损的关节软骨往往会引发关节疼痛、骨关节炎和关节功能障碍。目前,临床上常用微创骨折技术或自体骨软骨移植术来治疗早期的软骨损伤,而终末期退行性关节病变常采用全关节置换术作为标准手术。然而,这些技术并非理想的解决方案。因此,探索新的关节软骨修复方法至关重要。 干细胞为软骨修复和再生提供了新的可能。其中,胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是软骨修复的一种重要的细胞来源。ESCs是从囊胚发育阶段的内细胞团中分离出来的具有无限的自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体。自我更新是指ESCs可在适当的体外培养条件下无限增殖并保持其多能性状态,多向分化潜能则是指ESCs可在特定的体外诱导条件下分化为机体的任何类型细胞。目前研究人员已经通过多种方式将ESCs诱导分化为软骨前体细胞或软骨细胞,如模拟体内中胚层发育过程或与软骨细胞共培养等。然而,现有的诱导方法仍存在一些局限:(1)中胚层诱导分化效率不高且分离间充质细胞的步骤复杂;(2)尚缺乏稳定的、可重复的诱导分化体系。而这一过程的推进将极大依赖于对ESCs多能性维持和中胚层分化命运决定机制的解析。 体内外的研究表明,ESCs的命运决定受转录因子、信号通路、表观遗传和代谢等多种机制的协同调控。外部信号通路包括多能性维持相关的信号通路如LIF/STAT3、Wnt/β-catenin和BMP4/SMAD,分化相关的信号通路如FGF4/ERK和TGFβ/SMAD。内源性多能性基因调控网络(Pluripotency gene regulation network,PGRN)以Nanog,Sox2和Oct4为核心,它们通过自调节和反馈调节协同调控下游靶基因。当PGRN处于稳定状态时,ESCs维持在多能性状态;但当任何一个核心转录因子的功能明显减弱使PGRN的稳定性受损时,ESCs将启动分化程序。尽管这些研究丰富了我们对ESCs多能性维持和分化命运决定的认识,但我们仍然对参与调控这一过程的基因和信号通路缺乏较为全面的了解。 通过基因编辑技术修饰基因的表达是生命科学领域研究功能的一种常见手段。与RNA干扰技术相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术具备脱靶效率低、敲除效果好及操作简便等优点。CRISPR筛选,又称为高通量基因编辑技术,是基于CRISPR/Cas9系统的一种方法。它通过设计sg RNA敲除文库,同时在不同细胞中敲除多个基因。在采取特定的筛选策略后,进行高通量测序,并利用生物信息学分析寻找潜在的候选靶基因。目前,CRISPR/Cas9功能基因组筛选已被广泛应用于肿瘤细胞中耐药基因、合成致死基因和转移相关基因以及ESCs中自我更新相关基因的筛选与鉴定,成为批量评估基因功能的有效手段。 研究目的 基于此,本研究首先利用CRISPR/Cas9功能基因组筛选鉴定与ESCs多能性维持和中胚层分化相关的基因,然后基于多组学数据(功能基因组学、转录组学和表观组学)的整合分析重构ESCs的命运决定调控网络。本研究旨在基因组范围内鉴定可能调控ESCs多能性维持和中胚层分化的全部基因,为解析ESCs命运决定的分子机制提供线索,并为ESCs在软骨修复领域的应用奠定基础。 研究方法和结果 1.多能性维持相关基因的筛选、鉴定和分析 利用全基因组的CRISPR/Cas9敲除文库,本室分别鉴定到2930个负富集基因(可能促进多能性维持)和1384个正富集基因(可能抑制多能性维持)。富集分析结果显示,负富集基因在m ESCs中高表达,且其主要参与细胞生存必需和多能性维持相关的生物学过程,如DNA复制、RNA代谢、干细胞种群维持、组蛋白修饰和细胞周期等。表型检测结果显示,敲除负富集基因导致m ESCs的增殖能力减慢、克隆形成能力降低,表现出多能性状态受损的表型。 2.中胚层发育相关基因的筛选、鉴定和分析 利用全基因组的CRISPR/Cas9敲除文库,本室在中胚层诱导分化条件下

关键词： 冠状病毒   同源重组工程   BAC转座   脂质体转染   人源化小鼠模型  

摘要： 冠状病毒(CoV)是导致人类疾病的一大病毒家族,目前已经发现了 7种冠状病毒会感染人类宿主并引起不同程度的呼吸道疾病。2019年SARS-CoV-2的全球蔓延,对全球公共卫生及经济发展带来了巨大威胁与挑战。小鼠基因组与人类基因组具有高度的同源性,一直是研究病毒感染致病机制和治疗对策的最重要的活体平台。但是,由于物种壁垒的存在,人类冠状病毒并不能有效的感染野生小鼠,因此需要对小鼠进行人源化改造。虽然已有冠状病毒人源化小鼠动物模型从不同层面上揭示了冠状病毒的感染致病机制,并模拟出了部分人类临床症状(病毒复制、体重减轻、间质性肺炎、肺部炎症、肺部损伤、嗅觉损伤等),为疫苗研发提供了重要帮助。但是目前还没有哪一个人源化小鼠模型可以模拟出人类冠状病毒患者的所有临床症状以及免疫反应。所以,需要继续改进和探索新的方法建立合适的动物模型来研究冠状病毒的发病机制和临床表现。在这项研究中,我们利用DNA同源重组工程,PiggyBac-on-BAC或Sleeping Beauty技术开展了冠状病毒受体ACE2、DPP4和APN的人源化小鼠胚胎干细胞的研发工作。利用重组工程成功实现了将小鼠冠状病毒受体Ace2、Dpp4、Apn基因编码区序列精确替换为基于BAC的人类同源序列,并在BAC两端插入了Sleeping Beauty和PiggyBac两种转座酶识别的反向重复序列(IRs),保证在进行转座时,BAC载体序列不会插入到小鼠基因组中;同时在编码区两端各保留约40kb的小鼠基因组,防止了位置效应。通过脂质体转染的方式,将修饰后的BAC与SB转座酶表达质粒共转染进小鼠胚胎干细胞,通过PCR基因型鉴定成功获得了多个hACE2、hDPP4、hAPN人源化小鼠胚胎干细胞株,并通过RT-qPCR检测和分析了人源基因在不同小鼠胚胎干细胞株中mRNA表达水平的差异。在后续工作中,将通过囊胚内注射BAC转座修饰的ES细胞产生转基因小鼠,从而获得基因表达更准确的人源化小鼠模型。这些小鼠模型有三个基本优点。首先,利用小鼠同源基因的内源性启动子表达人类基因。其次,编码序列完整,内含子中包含潜在的调控因子。第三,我们构建了三种具有不同受体冠状病毒的人源化小鼠模型。未来,新型冠状病毒大流行很有可能通过其中一种受体感染人类。这些人源化小鼠模型将为致病机制研究、免疫分析以及疫苗和药物开发提供关键工具。

关键词： 肝细胞癌   外膜囊泡   自转运蛋白Hbp   单链抗体hGC33   靶向效应  

摘要： 背景 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)是一种膜表面蛋白,是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的重要分子靶向标志物。已有研究制备了单克隆抗体hGC33,其可变区序列经柔性肽连接成单链抗体hGC33(Single-chain antibody hGC33,hGC33-sc Fv)能特异性识别GPC3的抗原识别功能域,可以增强HCC的特异靶向性。 革兰氏阴性菌分泌的外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)对肿瘤缺氧区具有一定的靶向性。为了进一步增强OMVs的肿瘤靶向特性,可以通过基因工程、化学工程等技术手段在OMVs上定向修饰识别肿瘤特异性抗原的异源多肽。 异源多肽在OMVs表面展示后,与肿瘤特异性抗原的结合能力优于多肽包裹在OMVs内部。在蛋白展示系统中有一种大肠杆菌自转运蛋白血红蛋白蛋白酶Hbp,由N端信号肽、分泌或表面显示的乘客结构域和膜上C端易位单元多肽组成,其中乘客域与异源多肽基因融合可呈递蛋白表面展示。 在这里,我们通过自转运蛋白Hbp与hGC33-sc Fv基因片段融合,诱导融合蛋白hGC33-sc Fv-Hbp在大肠杆菌及其分泌的OMVs表面展示。hGC33-OMVs作为生物纳米载体,可能开发出一种新的有效地特异靶向载体,增强OMVs对HCC的靶向效应及抗肿瘤效应。 目的 1.构建重组表达载体p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp和重组表达菌株BL21(DE3)/p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp,优化重组表达菌株融合蛋白hGC33-sc Fv-Hbp的表达条件; 2.重组表达菌株hGC33-OMVs的分离纯化鉴定与膜蛋白分子表征; ***33-OMVs的肝细胞癌靶向效应验证。 方法 1.载体构建:将Hbp和hGC33-VHk/VLa融合基因序列插入表达载体p ET28a中,构建重组表达载体p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp,转染进大肠杆菌BL21(DE3)中,含kana的LB平板培养基筛选获得重组表达菌株BL21(DE3)/p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp,液体培养基扩增培养14 h,取细菌菌液送公司基因测序。质粒提取试剂盒提取重组表达载体p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp,选择XhoⅠ、NcoⅠ双酶切,酶切片段琼脂糖凝胶电泳鉴定分析。 2.重组表达细菌分别培养6 h/8 h/10 h后,加入IPTG诱导剂诱导融合蛋白hGC33-sc Fv-Hbp表达,并优化融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达条件,Western blot分析IPTG诱导剂浓度和细菌培养时间对融合蛋白表达量的影响,免疫电镜分析hGC33-sc Fv-Hbp的细胞定位情况。 重组表达菌株在优化表达条件下培养后,差速离心法联合超滤浓缩法分离纯化重组表达菌株外膜囊泡(hGC33-OMVs)沉淀,通过纳米粒径分析、透射电镜观察确定hGC33-OMVs的形态及粒径分布。SDS-PAGE、Western blot检测hGC33-OMVs中Omp A、Omp C及hGC33-sc Fv-Hbp的表达。 3.肝癌细胞Hep G2与PHK26标记的hGC33-OMVs、wt OMVs共孵育24 h,DAPI处理Hep G2细胞,荧光显微镜观察Hep G2对OMVs的摄取吸收情况。建立裸鼠肝细胞癌Hep G2皮下移植瘤模型,将裸鼠分为wt OMVs组和hGC33-OMVs组,每组4只。尾静脉注射OMVs后,1 h、3 h、6 h、12 h采集小动物活体荧光图像,观察hGC33-OMVs、wt OMVs在裸鼠体内的聚集情况。 结果 1.重组基因片段hGC33-sc Fv-Hbp优化后密码子长度4901 bp,氨基酸长度1629 aa。重组表达菌株中p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp基因测序结果显示,7个测序片段的波形标准,无套峰。测序结果与理论序列对比无基因突变。酶切电泳结果显示酶切片段条带约4900 bp。测序结果和酶切电泳均证明重组表达载体p ET28a-hGC33-sc Fv-Hbp及重组表达菌株构建成功。 2.重组融合蛋白hGC33-sc Fv-Hbp的理论分子量为175.3 k Da,6 h、8 h、10 h三个诱导时间点加入终浓度为0.5 m M的IPTG溶液,SDS-PAGE中175.3 k Da蛋白分子量位置无明显条带,Western blot结果显示hGC33-sc Fv-Hbp分子量为175.3 k Da。细菌培养时间和IPTG诱导剂浓度优化结果显示,4 h培养时间目的蛋白表达量最高(p<0.05),诱导剂浓度不影响蛋白表达(p>0.05)。融合蛋白的最