关键词：
乙型肝炎病毒
cfDNA
高通量捕获测序
HBV-DNA整合
摘要：
目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染肝细胞是导致慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）及肝硬化（Liver cirrhosis,LC）和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的危险因素。目前国内外慢性乙型肝炎指南均将“功能性治愈”（HBs Ag清除或发生血清学转换）作为临床治疗慢性乙型肝炎患者的理想终点。但是由于HBV感染肝细胞后,部分整合到宿主基因组的HBV-DNA包含完整的HBs Ag开放阅读框,能够表达HBs Ag。因此血清中HBs Ag具有双重来源途径:来自于ccc DNA转录和整合HBV-DNA转录。
既往对HBV-DNA整合检测多采用肝脏活检组织,检测方法包括传统Alu-PCR以及inv PCR等,传统方法复杂低效,除了不能准确检测出HBV-DNA整合,而且是有创检测,临床应用性不高。因此建立一种高灵敏度、精准的检测策略尤为重要。本研究旨在开发和优化基于探针捕获的高通量测序和生物信息学分析流程的检测策略,通过对HBV整合或感染的细胞模型进行检测,验证该方法的有效性和准确性,再应用到临床CHB血浆cfDNA样本,建立一套血浆cfDNA无创检测HBV-DNA整合的检测策略,最后分析了HBV感染的不同疾病阶段HBV-DNA整合特征。
方法:
（1）通过Alu-PCR和TA克隆方法,对Hep G2.2.15和Hep AD38两种整合细胞系进行HBV-DNA整合的扩增和鉴定。
（2）生物信息学分析流程的优化和评估:通过人工合成HBV-DNA整合的复合参考序列（CRS）,制备不同稀释比例的复合参考序列与人基因组DNA的混合基质,进行检测和分析。对分析流程进行优化,对分析工具进行性能比较,对支持唯一序列的均一化数（nnsus）的Cutoff值和有效性、最低检出限、序列饱和度进行评估。
（3）HBV整合细胞系及Hep G2-NTCP感染模型中检测HBV-DNA整合:HBV整合细胞系Hep AD38与Hep G2.2.15直接收集细胞提取细胞内基因组DNA。病毒感染Hep G2-NTCP细胞后,分别采用q PCR（Quantitative PCR,q PCR）,酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测病毒的复制参数:包括细胞内的病毒复制中间体以及HBV RNA,细胞上清分泌的病毒相关蛋白,收集感染细胞内基因组DNA。采用数字液滴PCR（digital drop PCR,dd PCR）,根据每个细胞6.667 pg/hg DNA的估计值,通过量化β-Globin的量来计算细胞数量。对提取的细胞内基因组DNA进行建库并探针捕获富集,然后使用Illumina Nova Seq 6000对捕获的文库进行高通量测序。
（4）临床患者血浆cfDNA中HBV-DNA整合片段的检测:收集25例HBe Ag阴性,不同疾病阶段的HBV感染患者（9例CHB,10例LC,6例HCC）10 ml全血,提取血浆cfDNA,采用Qubit进行定量质检,探针捕获建库,最后上机Illumina Nova Seq 6000进行高通量测序。
（5）对探针捕获高通量测序分析结果进行验证:设计针对HBV-DNA整合断点的引物,采用普通PCR进行扩增,扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳以及一代测序比对分析进行HBV-DNA整合断点的鉴定。
结果:
（1）采用传统的Alu-PCR方法扩增HBV-DNA整合效率低,非特异性强,未能在Hep G2.2.15与Hep AD38两种整合细胞系中有效检测出病毒DNA的整合断点。
（2）采用30条人工合成序列与人基因组DNA混合形成模拟样本作模板,测序原始数据采用建立的方法与传统HIVID分析方法进行性能比较,结果显示我们的分析工具具有更高的灵敏度和准确度。当nnsus的Cutoff值为0.7时检测效果最佳,阴性对照噪音背景能够完全过滤。在10M reads数时,达到了分析的序列饱和度。比较10M和38M rea ds数下每个复合参考序列（CRS）的nnsus,Pearson相关系数为0.96（P<0.05）。在10M reads数下,最低检测限（LOD）为26.39 copies/μL。
（3）细胞内HBV 3.5kb RNA或分泌的HBe Ag水平在感染第一天时较低,在感染第三天时显著增加,感染三天后,细胞内HBV DNA与HBV 3.5kb RNA的水平继续增加。同时,在三次独立实验的12个样本中一共检测到112个HBV-DNA整合断点。整合频率范围分布从3.04×10-4到15.5×10-3个细胞/整合。HBV整合断点在人类染色体上随机分布（P>0.05）,在HBV基因组上集中富集在nt1500-1900（42/112,37.5%）之间
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