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关键词： 蓝藻   赤藓糖醇   光驱固碳   辅因子   前体供应  

摘要： 赤藓糖醇,作为一种新型的天然甜味剂,由于其特殊的性能和生理作用,广泛用于食品、医疗、美容、药品等领域。近年来,随着合成生物学和代谢工程的迅猛发展,人们对利用微生物合成赤藓糖醇的理解逐步深入,成功构建了新型的微生物细胞工厂。葡萄糖作为工业发酵生产赤藓糖醇的碳源,由于其价格昂贵,因此迫切需要找到可再生的廉价底物代替葡萄糖,从而降低合成赤藓糖醇的底物成本。鉴于二氧化碳过度排放引发的全球气候变化问题日益严峻,将二氧化碳转化为高附加值产品成为一项具有实际意义的低碳减排技术。蓝藻已经成为基础光合作用研究和光自养产生化学物质（如生物塑料、生物燃料和萜类化合物）的模式生物。这主要源于蓝藻具有利用太阳能通过光合作用产生NADPH介导的还原作用的内在能力,从而避免了异养和无细胞体系中辅因子获取的问题。 本研究从水果中筛选出3种不同的酵母,分别属于Saccharomyces cerevisiae属,Pichia kudriavzevii属以及Debaryomyces hansenii属。通过薄层层析法和高效液相色谱法对发酵液进行定性和定量分析,最终得到了一株生长迅速,葡萄糖消耗较快,且赤藓糖醇产量较高的酵母菌株Saccharomyces cerevisiae MZ-1。经PCR及测序验证,鉴定了Saccharomyces cerevisiae MZ-1中存在赤藓糖还原酶基因GRE3和GCY1。将上述基因分别与来自Escherichia coli K12 MG1655的磷酸酶基因yid A共同导入野生型Synechococcus elongatus PCC 7942中,构建蓝藻工程菌株AM和BM。在相同条件下,AM和BM的生长速率较Synechococcus elongatus PCC 7942迟缓。推测可能是由于碳流更多地流向生产赤藓糖醇,或构建合成赤藓糖醇的途径使蓝藻细胞内辅因子不平衡所致。AM和BM均能生产赤藓糖醇,其中AM的赤藓糖醇产量较高,培养21 d可达到108.60 mg/L。通过分析AM和BM中目的基因转录情况,发现在相同条件下,AM中yid A基因的转录水平是BM中yid A基因的6.5倍,且AM中GRE3基因的转录水平是BM中GCY1基因的17.4倍。推测AM的赤藓糖醇产量高于BM是由于AM的目的基因转录水平整体高于BM。因此,选用yid A与GRE3的基因组合进行后续实验。 在此基础上,对辅因子进行了额外补充,对前体供应也进行了优化。通过单独或组合过表达来自Escherichia coli K12 MG1655的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因GND以及转酮酶基因TKTA,构建蓝藻工程菌株CM、DM、EM、FM、GM、HM和IM。结果发现,单独或组合过表达ZWF和GND基因均使蓝藻工程菌株的生长得到恢复,其中EM的生物量最高,OD730nm达到了5.38,相比于AM,提高了19%,并且恢复到Synechococcus elongatus PCC 7942生物量的95.2%。可能是补充额外的辅因子维持了蓝藻细胞生物量与赤藓糖醇生产之间的平衡。此外,与AM相比,7个蓝藻工程菌株的赤藓糖醇产量均有不同程度的增加,说明通过平衡辅因子以及优化前体供应,能有效增强蓝藻合成赤藓糖醇的能力。其中,IM的赤藓糖醇产量最高,在21 d可达到256.44 mg/L,相比于AM,提高了236%。 通过构建光驱固碳合成赤藓糖醇的细胞工厂,成功实现了赤藓糖醇的可持续合成。不仅凸显了光合生物技术在合成生物学领域的巨大应用潜力,为丰富光合生物在赤藓糖醇等生物基化学品绿色生物制造领域中的应用奠定了基础。

关键词： 混合式教学   基因工程   课程思政教育   教学策略  

摘要： 随着科技飞速发展,基因工程作为生物技术的前沿领域,正逐渐渗透到生活的各个角落。然而,技术的进步往往伴随着伦理、法律和社会问题的涌现。在基因工程这门课程的教学中挖掘思政元素,融入思政教育,对于培养具有高度社会责任感和伦理观念的基因工程人才至关重要。本文在基于混合式教学开展基因工程课程思政教育优势的基础上,结合实践经验提出了五点切实可行的教学策略,以期为相关研究提供借鉴和思路。

关键词： 细胞命运转变   胚胎干细胞   2CLCs细胞   内质网应激   Thapsigargin   PERK-ATF4  

摘要： 细胞命运转变是指细胞从一种类型转变为另一种细胞类型的过程。胚胎干细胞（mESC）是一群具有自我更新和分化潜能的多能干细胞,能够分化形成外胚层的所有细胞类型,但缺乏形成胚胎外组织的能力,不能产生胎膜和胎盘。近年来,研究者在m ESC和iPSC的体外培养过程中,发现存在一小部分（0.1～1%）瞬态细胞,这类细胞能够参与生成胚胎外组织,被称为类全能干细胞。此外,这类细胞在转录水平上高表达MERVL（murine endogenous retrovirus with leucine tRNA primer）在内的内源性病毒逆转录元件以及具有卵裂阶段（2C）特异性的Zscan4（zinc finger and SCAN domain containing 4）,因此也被称为2-cell-like细胞（2CLCs）。2CLCs相比于mESC,具有发育全能性,是研究合子基因组激活（ZGA）以及多能性向全能性转变的理想模型。进一步研究发现,mESC中DUX异常表达能够激活MERVL以及Zscan4,诱导大量的2CLCs产生。 内质网（ER）主要负责蛋白质合成,组装以及加工。当细胞受到外部或内部影响导致内质网功能紊乱时,会引发内质网应激（ER-stress）以应对细胞微环境的变化,其特征是错误折叠或未折叠蛋白质（UPR）大量积累,这一过程称为内质网未折叠蛋白反应(UPRER)。此时,内质网会通过下调蛋白翻译速率,上调内质网分子伴侣蛋白（GRP78/GRP94）的表达以应对错误折叠蛋白质的产生。GRP78/GRP94上调是内质网应激启动的标志,内质网应激是细胞的防御性保护机制,其目的是恢复细胞正常生理状态,当细胞内质网损伤不可逆时,细胞最终会启动凋亡程序。内质网应激在肿瘤和免疫中被广泛研究,但其是否能调控多能性向全能性转变以及调控ZGA还鲜有报道。 因此,本课题拟探究内质网应激在mESC-2CLCs转变中的作用及分子机制。通过检测不同多能性状态下的干细胞（包括EpiSCs,OG2-ESCs,2CLCs）内质网Marker蛋白GRP78表达水平,作者发现类二细胞期细胞（2CLCs）GRP78蛋白表达量最低,同时还观察到mESC-to-2CLCs转变过程中GRP78蛋白表达下调,判断多能干细胞和全能干细胞对错误折叠或未折叠蛋白的调控存在差异。在利用内质网应激诱导剂Thapsigargin处理mESC诱导内质网应激,发现GRP78蛋白表达量增加同时mESC-to-2CLCs转变效率显著提高。后续研究表明Thapsigargin引起的内质网应激不依赖SERCA抑制,且其它钙调控化合物小分子无法有效促进或者抑制2CLCs转变,揭示Thapsigargin促进mESC-to-2CLCs转变与胞质钙离子变化无关;进一步研究中作者确定了Thapsigargin是通过启动内质网未折叠蛋白反应(UPRER)激活PERK-ATF4通路促进mESC-to-2CLCs的高效转变。然而,内质网抑制剂Kira6作为IREI-XBP1通路抑制剂也能够抑制Thapsigargin对2CLCs转变的促进作用,这很可能与IRE1与PERK形成的二聚体受到抑制有关,表明PERK磷酸化对2CLCs转变同样重要。

关键词： 产业化   基因污染   侵权   归责原则   构成要件  

摘要： 转基因技术能够改良作物品种,提高粮食产量,转基因作物产业化势不可挡。但随着转基因作物种植面积的逐渐扩大,转基因作物基因污染现象在国内外时有发生。国外对转基因作物基因污染侵权领域的归责原则、损害赔偿等内容有较为详细的讨论,并已形成多部法律,但我国目前尚未对转基因作物污染侵权问题进行系统探讨。本研究从侵权法的角度出发,对转基因作物基因污染侵权进行概念界定与辨析,梳理我国转基因作物产业化的政策导向与基因污染侵权责任的规范现状,分析域外转基因作物基因污染侵权责任的立法现状,从归责原则、构成要件、减免责事由、责任承担等角度对《民法典》侵权责任编进行积极解释使用。 本研究主要从以下几方面展开:第一部分通过对转基因作物基因污染进行概念界定,分析转基因作物基因污染可造成生物多样性破坏和经济损失。论述转基因作物基因污染侵权的含义,并将该侵权类型认定为环境污染侵权,与相近概念进行辨析。同时指出文章中主要从请求权基础理论和风险社会理论来进行分析。第二部分分析我国转基因作物产业化的进程和基因污染的现状,梳理我国目前关于转基因作物基因污染侵权的法律法规,总结出应对转基因作物基因污染侵权的请求权基础规范不足,风险预防措施存在不足。第三部分以国际条约、大陆法系、英美法系关于环境污染侵权尤其是基因污染侵权的法律法规为比较对象,从专门立法、归责原则、损害赔偿、预防措施等方面给我国转基因作物基因污染侵权责任应如何进行分析提供思路。第四部分从释法角度将《民法典》相关侵权责任规定积极解释适用到转基因作物基因污染侵权责任领域,以期为可能发生的转基因作物基因污染侵权提供理论依据,推动转基因作物产业化发展。最后在风险预防原则的指导下对建立转基因作物基因污染保险制度的建立进行了展望。

关键词： 生物基因工程   医药领域   生物技术   DNA   分子生物学  

摘要： 近年来，在我国科学技术迅猛发展的同时，生物基因工程也在大力推广现代生物技术。作为现代生物技术的产物，生物基因工程在医药领域扮演着十分重要的角色，使医疗水平得到了极大提升，推动了医疗产业的发展，也为人们的健康生活提供了保障。本文首先对生物基因工程进行概述，其次总结了生物基因工程在医药领域的具体应用，并对生物基因工程应用的利弊进行了分析，最后对生物基因工程未来发展进行展望。

关键词： 三唑类杀菌剂   小鼠胚胎干细胞   发育毒性   视黄酸   组蛋白修饰  

摘要： 农药残留造成的食品安全和环境污染一直备受关注。三唑类杀菌剂(TFs)因其广谱、高效、长效等优点,被广泛用于农业生产中,以保护多种作物。它们在施用过程中可渗透到附近的土壤和水环境中,而且由于其具有长期保留、生物降解性有限、易于在环境中移动等特性,对土壤和水生生物产生有害影响。有证据表明,在非目标物种中,动物和人类可能通过食道、呼吸道和皮肤接触途径暴露于TFs,导致内分泌干扰作用、生殖毒性、心脏毒性、肝毒性、神经毒性等不良反应。然而,TFs是否具有发育毒性效应及其相关作用机制尚不明确。小鼠胚胎干细胞(mESCs)具有发育成为神经、心脏等多种细胞类型的潜能,是研究发育毒性的重要工具。因此,本研究基于mESCs及其3D拟胚体(EB)和神经分化模型,揭示TFs在胚胎发育早期的不良发育毒性结局,并阐明其分子起始事件,旨在为TFs的健康效应评估提供实验数据和理论支持。主要研究内容如下: 1、本部分研究首先在体外细胞活力实验中发现,TFs对mESCs的细胞活力有时间和剂量依赖效应,结合TFs环境暴露浓度,选择0.5μM的亚致死浓度作为后续分化实验的暴露浓度。然后,构建基于mESCs的3D EB分化模型,通过形态学观察,发现在EB形成过程中,mESCs首先变成“米粒”聚集体,然后向实心黑球转化,最后慢慢空泡化;借助实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现,外、中、内三胚层标志物(Fgf5、Mixl1、Gata6)在分化不同窗口期时间依赖性显著表达增加;而TFs暴露后,能够显著抑制标志物Fgf5、Mixl1的转录表达,提示TFs的潜在发育毒性。 2、为了深入探究TFs造成发育毒性的分子机制,我们将目光指向与发育息息相关的视黄酸(RA)信号通路。本部分研究中,首先分析了六种TFs暴露对RA信号传导中视黄酸合成酶(Aldh1a2)、视黄酸结合蛋白(Crabp1,Crabp2)、视磺酸羟化酶(Cyp26a1)、RA受体(Rara)、视黄醇结合蛋白(Rbp1、Rbp4)和视黄醇脱氢酶(Rdh1)等基因的影响。实验结果显示,在EB分化过程中,对照组RA信号通路相关基因表达有所升高,与此同时,在每个EB分化节点,TFs会相应的上调RA相关基因,尤其是在第7天时,苯醚甲环唑(DIF)显著上调三个RA信号传导相关基因的表达(Crabp1、Rbp1、Rbp4),而氟硅唑(FLU)处理组则显著上调六个RA信号传导相关基因(Aldh1a2、Crabp2、Cyp26a1、Rara、Rbp1、Rbp4)。酶联免疫吸附实验(ELISA)结果显示,TFs暴露EB 14天后,DIF和FLU处理组会相应增加细胞内RA总含量。分子对接和分子动力学模拟发现,TFs能与RA关键受体亚型RARα稳定结合。分子力学/泊松-波尔兹曼表面积(MM/PBSA)法计算得到的结合自由能表明范德华能是TFs与RARα结合的主要驱动力,而极性溶剂化能是结合的主要抑制力。其中,DIF与RARα的对接结合能最低,而FLU与RARα可以形成三个氢键且MM/PBSA结合自由能最低。由此提示,DIF和FLU具有更强的RA介导的发育毒性。 3、本部分研究中,通过建立mESCs单层神经分化模型探究TFs潜在的神经发育毒性。在本部分mESCs体外神经分化实验中发现,TFs有效的促进了神经分化标志物(Dcx、Map2)的表达,促进细胞内钙离子的增加,扰乱5-羟色胺(5-HT)神经递质代谢。组蛋白修饰在神经发育过程中发挥重要的调控作用,为此通过RT-PCR实验检测了TFs对组蛋白H3K27me3去甲基转移酶(Kdm6a、Kdm6b)和甲基转移酶(Ezh2)的影响,发现TFs能够干扰组蛋白去甲基转移酶Kdm6b的表达。此外,分子对接分析、聚类分析和多元线性回归分析揭示了DIF和FLU相比于其他TFs对于mESCs神经分化进程有着更强的促进作用。进一步通过染色质免疫沉淀分析发现DIF和FLU通过显著降低5-羟色胺受体Htr2c基因启动子区H3K27me3的富集改变5-HT表达。以上结果表明TFs能够通过组蛋白修饰扰乱神经递质代谢进而诱导神经发育损伤。 综上所述,基于mESCs体外诱导EB分化和神经分化模型,本研究考察了低剂量TFs的发育毒性,并从视黄酸信号通路和组蛋白修饰的角度解析了TFs造成发育损伤的潜在分子机制,为TFs的健康风险评估和管控提供了实验数据。

关键词： Risk assessment  

摘要： This paper highlights the progress made by the Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues (JMPR), the European Union European Food Safety Authority (EFSA), the U.S. Environmental Protection Agency (EPA), and the Japanese Pharmaceutical Affairs and Food Sanitation Council (PAFSC) on the residues risk assessment of glufosinate-ammonium registration on transgenic crops, focusing on the metabolism of glufosinate-ammonium in transgenic crops, the animal metabolism, the methods of residue analysis, storage stability, supervised residue trials, toxicological evaluation, residue definitions, and maximum residue limit (MRL) setting were summarized and analyzed. Compared with non-genetically modified crops, new metabolic pathways have emerged after the use of glufosinate-ammonium in transgenic crops. The metabolite N-acetyl-glufosinate (NAG) is the main residue of glufosinate-ammonium in transgenic crops, and thus relevant countries and organizations have included it in the residue definition of glufosinate-ammonium. The higher residue levels of glufosinate-ammonium in transgenic crops than in non-genetically modified crops are mainly related to the technical characteristics of glufosinate-ammonium use on transgenic crops and the emergence of new metabolites. Currently, no distinction is made between non-genetically modified crops and transgenic crops on MRLs for glufosinate-ammonium. The authors believe that when carrying out risk assessment of pesticide residues in transgenic crops, corresponding metabolism tests should be carried out first, and residue data should be reasonably selected based on the principle of risk maximization to formulate uniform MRLs. This paper can provide a reference for improving the technical level of pesticide residue risk assessment and developing MRL standards for pesticide application on transgenic crops in China. © 2024 Editorial Office of Chinese Journal of Pesticide Science. All rights reserved.