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关键词： 黑曲霉   柠檬酸   代谢调控   交替氧化酶   柠檬酸转运蛋白   糖转运蛋白  

摘要： 柠檬酸的市场需求比较广泛,可以应用于食品、美容、医疗、化工等多个行业。目前我国柠檬酸的生产工艺大多为黑曲霉发酵玉米液化液法,但发酵生产仍然存在原料利用率低、生产能耗高等一系列问题。黑曲霉菌株的筛选与改造是工业生产的基础,对柠檬酸发酵过程及其产品生产都有着重要作用。虽然柠檬酸的生产途径已得到了清晰的解析,但无论是模式菌还是工业菌株大多数都只从单一方面进行基因改造来探究其对柠檬酸产量的影响,对于多条途径相结合的探究相对较少。通过将多种促进柠檬酸积累的相关基因在菌株内超量共表达,减少ATP对代谢流的抑制作用、增强底物胞内输入、强化柠檬酸胞内和胞外的运输能力,从而有效应用于发酵工业,降低生产成本。 首先,本论文以黑曲霉CGMCC 10142为出发菌株,通过农杆菌介导方式将敲除pyr G基因同时过表达aox1基因的质粒导入,获得原位敲除菌株Δpyr G-2、Δpyr G-3。经摇瓶发酵分析,突变菌株Δpyr G-2相较于原始菌株CGMCC 10142产酸没有提高,其产酸量降低了2.2%;而突变菌株Δpyr G-3产酸有略微提高,其产酸量提高了1.2%。q RT-PCR结果表明,在所有基因中,Δpyr G-3菌株中与aox1基因表达趋势一致的是cex A和cs两个基因,说明aox1过表达可能会促进这两个基因表达量升高,从而有利于促进柠檬酸产量的增加。 其次,以黑曲霉突变菌株Δpyr G-3为出发菌株,通过农杆菌介导方式将过表达hgt1和cex A基因的质粒导入,获得随机插入菌株Δpyr G-94-7、Δpyr G-95-1、11、12、18、23、Δpyr G-9495-2、8、19、20。经摇瓶发酵分析,突变菌株Δpyr G-94和Δpyr G-9495相较于原始菌株CGMCC 10142产酸都没有明显提高,而只有Δpyr G-95-1、Δpyr G-95-23产酸有所提高,其产酸量分别提高了5.0%和1.6%。 再次,以黑曲霉突变菌株Δpyr G-94-7、Δpyr G-95-1、Δpyr G-9495-8为出发菌株,通过农杆菌介导方式将回补pyr G基因同时过表达ctp A基因的质粒导入,获得随机插入菌株13-94-1、3、13、16、17,13-95-2、3、4、7,13-9495-3、10、16、20。经摇瓶发酵分析,突变菌株13-9495相较于原始菌株CGMCC 10142产酸都没有明显提高,而13-94-3和13-95-3的产酸能力有所提高,其产酸量分别提高了2.7%和4.4%。 最后,通过30 L发酵罐发酵结果和q RT-PCR结果表明,与CGMCC 10142相比,突变菌株13-94-3与CGMCC 10142的糖酸转化效率接近一致,但生产周期却缩短了8个小时,发酵强度为3.1 g/L/h,且在柠檬酸转运水平方面显著增强,有利于柠檬酸的积累。

关键词： 枯草芽孢杆菌   表面活性素   基因工程   CRISPR-Cas9   发酵条件优化  

摘要： 表面活性素surfactin是一类由芽孢杆菌产生的一种脂肽类生物表面活性剂,由于具有良好的物化特性和生物活性,surfactin在石油开采、医药制剂、农业和化妆品食品等领域应用广泛,市场需求极大。然而,天然菌株的低产量、高成本使surfactin的生产和应用受到严重限制。 基于此,本文以Bacillus subtilis ATCC 21332为出发菌株,首先利用同源重组技术将srf A合成酶原始启动子Psrf A更换为3种强启动子,探究了启动子对surfactin合成的影响,结果表明3种启动子P43、Pveg、Pamy E的替换可显著增强surfactin产量,效果最好的启动子Pveg替换后最高产量可达3.59 g/L,相较于野生型提高了28.2%。 但是,由于同源重组方法用时长,效率低,因此本文在出发菌株中建立了CRISPR-Cas9基因编辑系统。通过CRISPR-Cas9技术敲除surfactin合成过程负调控因子pho P、cod Y、sin I;敲除芽孢合成途径关键基因spo0E、spo IVB;biofilm合成途径关键基因sip W、tas A;强化了surfactin的表达水平,7个关键基因分别敲除后得到的重组菌株产量均有提升,其中产量提升最高菌株的是pho P基因敲除后的工程菌,最高产量为4.17 g/L,相较野生型提高了49%。 为了快速筛选具有高产surfactin性能的工程菌株,优化了CPC-BTB显色筛选法,获得了最佳反应体系与条件为:100μL CPC-BTB混合液与80μL样品混合,反应温度为30℃,于600 nm测吸光值,通过颜色变化表征surfactin产量,达到对工程菌株产量进行初步筛选的目的; 最后,对工程菌株发酵条件包括接种量、装液量、温度、p H和四种前体氨基酸的添加量进行了优化,获得最优发酵条件为:接种量4%(v/v),装液量30 m L/250 m L,温度37℃,p H为7,谷氨酸添加量2 g/L。使用最优发酵条件对10株工程菌株进行发酵,结果表明,相较于优化前,菌株的surfactin产量均能提升1.5-2倍,其中,surfactin产量最高的是*** ATCC 21332-Δsip W,发酵48 h后surfactin产量最高达5.98 g/L,相较野生型菌株提高了113.7%。 本研究为探究枯草芽孢杆菌中surfactin的合成机制提供了理论支持,为高产surfactin工程菌株的构建提供了一种有效的借鉴策略,对其工业化生产及应用奠定了理论基础,可为生物表面活性剂市场的可持续发展提供有力支持。

关键词： gadusol   毕赤酵母   基因工程   紫外吸收   抗氧化  

摘要： Gadusol是一种具有抗氧化能力的高效天然紫外吸收物质,广泛存在于微生物、藻类及鱼卵等水生生物中,可应用于化妆品、防晒品、医药等领域。天然提取gadusol产量极低且环境不友好,微生物细胞工厂具有安全可控、合成高效等优点,成为生产这类高附加值天然物质的主要方式。毕赤酵母是一种能高水平表达外源蛋白的酵母,同时能够实现高密度发酵。本研究以毕赤酵母GS115为出发菌株,异源表达并优化gadusol合成途径,提高关键前体物质景天庚酮糖-7-磷酸的积累,构建了一株能够利用木糖从头合成gadusol的毕赤酵母工程菌株,并对其合成的gadusol性质进行探究,为gadusol的工业化生产及应用提供了一定的理论基础。主要研究结论如下: 1、产gadusol毕赤酵母工程菌株的构建:构建表达斑马鱼来源gadusol合成基因EEVS和MT-Ox的工程菌株GS01,以葡萄糖为碳源进行gadusol的从头合成。进一步构建了木糖途径强化菌株GS03,在120 h的发酵周期中,合成gadusol 153.9 mg·L-1(35.0mg·g-1 DCW),产量是GS01菌株的47倍,木糖的使用是促进gadusol合成的有效策略。并在酵母胞外检测到gadusol,为后续的分离、纯化提供便利。基于gadusol具有特异性紫外吸收的性质,开发了一种利用紫外吸光强度对gadusol定量的新方法,与HPLC结果相比,紫外光谱扫描结果相对误差不超过9%,具有较高的准确性,可作为这类物质快速、简便的检测方法。 2、TAL1基因调控对gadusol合成的影响:在GS03中敲除PAS＿chr2-2＿0338基因,获得工程菌GS05,在木糖培养基中gadusol浓度为290.0 mg·L-1(83.0 mg·g-1 DCW)。发现TAL1相关基因的敲除对菌株的木糖利用能力产生负面影响,适当的TAL1表达对gadusol积累有积极作用。菌株GS05在含有5 g·L-1葡萄糖和15 g·L-1木糖的培养基中,具有最高的gadusol浓度382.9 mg·L-1,碳源消耗率可达90%。 3、毕赤酵母合成gadusol紫外保护能力与抗氧化能力分析:合成的gadusol紫外吸收波长随p H而变化,当p H 2.5时,吸收范围为240-290 nm,λmax=268 nm;当p H 7.0时,吸收范围为275-325 nm,λmax=296 nm。发酵提取物能有效保护细胞,提高细胞在UVC和UVB照射下的存活率。发酵产物具有还原金属离子和清除自由基的能力,FRAP法、ABTS法、DPPH法和PTIO法在反应5 h后分别出现90.8%、25.5%、132%和33.6%的变化率,且自由基清除实验在到达反应平衡后能保持较长时间的稳定清除效率,有作为长效抗氧化剂的潜在应用价值。

关键词： 游离DNA   片段组学   表观遗传学   亚硫酸氢盐测序   无创产前检测  

摘要： 背景:游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)是指由细胞死亡或主动分泌等过程释放到血液等体液中的DNA片段,携带丰富的组织来源特异的生理和病理信号,是液体活检中的重要无创标志物。游离DNA的片段组学(fragmentomics)特征是游离DNA呈现的片段化模式,也是近年来新兴的关键分子特征,反映了游离DNA的非随机降解过程,在疾病早期诊断中具有重要价值。游离DNA甲基化测序可捕获游离DNA的表观修饰和解析组织来源状态,是游离DNA研究中的关键技术。全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)能以单碱基分辨率检测DNA中的胞嘧啶甲基化模式,已有研究表明,WGBS会对游离DNA造成人为的断裂,但是其对游离DNA片段组学特征的影响尚不清楚。本文旨在系统评估WGBS技术对孕妇cfDNA片段组学特征的影响,并探索利用单一测序方法分析cfDNA多维度特征(包括片段组学特征和表观遗传特征)的可行性。 方法:本研究对来自55位孕妇的66例孕妇外周血浆样本进行了配对的全基因组测序(WGS)和WGBS测序,全面比较了两种方法在测序质量、cfDNA片段组学特征、全基因组覆盖度和分布水平等方面的异同,并评估了WGBS在孕妇血浆胎儿DNA分数估算中的表现。 结果:本研究的结果显示,尽管相比WGS,WGBS技术略微增加了短片段的比例,引入了一定程度的GC含量偏好、末端基序频率及末端基序多样性的改变,以及基因组覆盖度的降低,基于WGBS技术分析的cfDNA片段长度分布,整体上仍保留了核小体保护的峰值特征和胎儿来源cfDNA片段的短片段偏好特征。同时,在其他关键片段组学特征方面,如核小体分布模式、基因调控信号(包括TSS附近和CTCF结合位点附近的cfDNA覆盖度分布)以及cfDNA片段的全基因组分布水平等,WGBS数据与WGS数据也表现出高度一致性。WGBS样本相比WGS样本频率显著增加的末端基序对应的cfDNA片段富含CpG位点,提示DNA甲基化可能与WGBS技术引入的cfDNA断裂模式有关。同时,WGBS估算的胎儿游离DNA浓度与WGS估算结果高度相关(皮尔森相关系数为0.996)。 结论:本研究证实了WGBS样本在cfDNA多种片段组学特征分析上的可行性,为无创产前筛查与母胎表观遗传学研究的联合进行提供了新的研究方向。同时,也为后续cfDNA多组学整合分析奠定了技术基础。

关键词： 贯穿式情境   结构化教学   大单元   基因工程  

摘要： 随着高中生物学新课程、新教材的推进，情境教学、项目化学习等多种教学方式备受重视，但在有效地推动“双新”教学的同时，也带来了新的难题，如多种教学方式的相互融合问题，贯穿式情境与教学过程的有机整合问题等。为此，文章基于建构主义理论和系统思维，对单元教学结构进行了解析，提出并阐述了基于贯穿式情境的结构化教学的内涵、操作路径和教学示例，帮助一线教师有效实施贯穿式情境，整体设计和宏观把握单元教学中学科核心素养的培育，从而纵深推进“双新”教学。

关键词： SOCIAL SCIENCE   Archaeology  

ISBN: (数字)9781803278360 ISBN: (纸本)9781803278360

摘要： Coming of Age is a collection of the AnthroEthics 2021conference proceedings, featuring additional chapters that,although not presented at the conference, align...

关键词： 紫杉木霉   角鲨烯   萜类化合物   基因工程  

摘要： 萜类化合物在食品、化妆品和医药等领域都具有重要的应用价值,从植物中提取萜类化合物具有产率低下、工艺复杂、植物生长缓慢、易受季节和区域变化影响等多种缺点,严重阻碍了萜类化合物的广泛应用。微生物生长迅速、培养条件容易控制、代谢途径相对明确且微生物生产成本低、效率高,因此,利用微生物生产萜类化合物具有较大的发展潜力。 本课题以实验室构建的以Tet-on::Cre-loxP为基础的潮霉素筛选标记重复利用系统的S2530为出发菌株,利用合成生物学技术,通过对前体物质的积累和MVA途径的强化,以角鲨烯的产量为表征,构建出了高效合成萜类化合物的紫杉木霉底盘细胞。主要内容如下: (1)MVA途径前体物质乙酰辅酶A的积累:过表达了黑曲霉来源的乙酰辅酶A合成酶(ACS),得到S2941菌株。S2941角鲨烯产量相较于S2530提高了19.51%左右。 (2)MVA途径的强化,在S2941的基础上分别过表达了内源的HMGR和黑曲霉来源的HMGR基因,分别得到了菌株S3056和S3057,通过对比角鲨烯的产量,证明黑曲霉来源的HMGR比内源的HMGR在紫杉木霉中更有效强化MVA途径,提高萜类化合物产量。之后依次过表达了内源的ERG19、IDI、ERG8、ERG12、ERG20基因,成功获得了菌株S4081,菌株S4081发酵5天角鲨烯产量为496.67 mg/L。 综上,本课题在紫杉木霉底盘细胞S2530中依次过量表达了黑曲霉来源的ACS和HMGR,自身来源的ERG19、IDI、ERG8、ERG12、ERG20基因,最终得到了ACS、HMGR、ERG19、IDI、ERG8、ERG12、ERG20过表达菌株S4081,角鲨烯产量达到496.67 mg/L,相较于出发菌株S2530提高了129.54%。成功构建了萜类化合物前体丰富的底盘菌株,为以后实现萜类化合物高效生产奠定了基础。